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顯微鏡的種類及原理



錄入時間:2011-9-16 14:47:39 來源:生物在線

1. 普通光學顯微鏡
  現代普通光學顯微鏡利用目鏡和物鏡兩組透鏡係統來放大成像,故又常被稱為複式顯微鏡。它們由機械裝置和光學係統兩大部分組成。機械裝置包括鏡座、支架、載物台、調焦螺旋等部件,是顯微鏡的基本組成單位,主要是保證光學係統的準確配製和靈活調控,在一般情況下是固定不變的。而光學係統由物鏡、目鏡、聚光器等組成,直接影響著顯微鏡的性能,是顯微鏡的核心。一般的顯微鏡都可配置多種可互換的光學組件,通過這些組件的變換可改變顯微鏡的功能,如明視野、暗視野、相差等。
  對任何顯微鏡來說,分辨率是決定其觀察效果的最重要指標。從物理學角度看,光學顯微鏡的分辨率受光的幹涉現象及所用物鏡性能的限製,可表示為:
   
  式中l為所用光源波長;q為物鏡鏡口角的半數,它取決於物鏡的直徑和工作距離(圖2-8);n為玻片與物鏡間介質的折射率,顯微觀察時可根據物鏡的特性而選用不同的介質,例如空氣(n=1.0)、水(n=1.33)、香柏油(n=1.52)等。n sinq也被表示為數值孔徑值(Numerical Aperture,NA),它是決定物鏡性能的最重要指標。光學顯微鏡在使用最短波長的可見光(l=450nm)作為光源時在油鏡下可以達到其最大分辨率,0.18 mm(表2-1)。由於肉眼的正常分辨能力一般為 0.25 mm左右,因此光學顯微鏡有效的最高總放大倍數隻能達到 1,000~1,500倍,在此基礎上進一步提高顯微鏡的放大能力對觀察效果的改善並無幫助。
 
  明視野顯微鏡的的照明光線直接進入視野,屬透射照明。生活的細菌在明視野顯微鏡下觀察是透明的,不易看清。而暗視野顯微鏡則利用特殊的聚光器實現斜射照明,給樣品照明的光不直接穿過物鏡,而是由樣品反射或折射後再進入物鏡(圖 2-9),因此,整個視野是暗的,而樣品是明亮的。正如我們在白天看不到的星辰卻可在黑暗的夜空中清楚地顯現一樣,在暗視野顯微鏡中由於樣品與背景之間的反差增大,可以清晰地觀察到在明視野顯微鏡中不易看清的活菌體等透明的微小顆粒。而且,即使所觀察微粒的尺寸小於顯微鏡的分辨率,依然可以通過它們散射的光而發現其存在。因此,暗視野法主要用於觀察生活細菌的運動性。
 
  光線通過比較透明的標本時,光的波長(顏色)和振幅(亮度)都沒有明顯的變化,因此,用普通光學顯微鏡觀察未經染色的標本(如活的細胞)時,其形態和內部結構往往難以分辨。然而,由於細胞各部分的折射率和厚度的不同,光線通過這種標本時,直射光和衍射光的光程就會有差別。隨著光程的增加或減少,加快或落後的光波的相位會發生改變(產生相位差)。光的相位差人肉眼感覺不到,但相差顯微鏡配備有特殊的光學裝置——環狀光闌和相差板,利用光的幹涉現象,能將光的相位差轉變為人眼可以察覺的振幅差(明暗差),從而使原來透明的物體表現出明顯的明暗差異,對比度增強。正由於樣品的這種反差是以不同部位的密度差別為基礎形成的,因此,相差顯微鏡使人們能在不染色的情況下比較清楚地觀察到在普通光學顯微鏡和暗視野顯微鏡下都看不到或看不清的活細胞及細胞內的某些細微結構,是顯微技術的一大突破,為此,其發明人F. Zernike獲得了1953年的諾貝爾獎。
 
  有些化合物(熒光素)可以吸收紫外線並轉放出一部分為光波較長的可見光,這種現象稱為熒光。因此,在紫外線的照射下,發熒光的物體會在黑暗的背景下表現為光亮的有色物體,這就是熒光顯微技術的原理。由於不同熒光素的激發波長範圍不同,因此同一樣品可以同時用二種以上的熒光素標記,它們在熒光顯微鏡下經過一定波長的光激發發射出不同顏色的光。熒光顯微技術在免疫學、環境微生物學、分子生物學中應用十分普遍。
 
5. 透射電子顯微鏡
由於顯微鏡的分辨率取決於所用光的波長,人們從本世紀初開始就嚐試用波長更短的電磁波取代可見光來放大成像,以製造分辨本領更高的顯微鏡。1933年,德國人E. Ruska 製成了世界上第一台以電子作為“光源”的顯微鏡----電子顯微鏡。其理論依據是:電子束通過電磁場時會產生複雜的螺旋式運動,但最終的結果是正如光線通過玻璃透鏡時一樣,產生偏轉、匯聚或發散,並同樣可以聚集成像。而一束電子具有波長很短的電磁波的性質,其波長與運動速度成反比,速度越快,波長越短。在理論上,電子波的波長最短可達到0.005 nm,所以電子顯微鏡的分辨能力要遠高於光學顯微鏡(圖2-10)。幾十年來,電子顯微技術發展很快,應用也日益廣泛,對包括微生物學在內的許多學科的進步都起了巨大的推動作用。 
 
6. 掃描電子顯微鏡
  掃描電子顯微鏡(Scanning Electron Microscope SEM)與光學顯微鏡和透射電鏡不同,它的工作原理類似於電視或電傳真照片。電子槍發出的電子束被磁透鏡匯聚成極細的電子“探針”,在樣品表麵進行“掃描”,電子束掃到的地方就可激發樣品表麵放出二次電子(同時也有一些其它信號)。二次電子產生的多少與電子束入射角度有關,也即是與樣品表麵的立體形貌有關。與此同時,在觀察用的熒光屏上另一個電子束也做同步的掃描。二次電子由探測器收集,並在那裏被閃爍器變成光信號,再經光電倍增管和放大器又變成電壓信號來控製熒光屏上電子束的強度。這樣,樣品上產生二次電子多的地方,在熒光屏上相應的部位就越亮,我們就能得到一幅放大的樣品立體圖像。
 
7. 掃描隧道顯微鏡
  在光學顯微鏡和電子顯微鏡的結構和性能得到不斷完善的同時,基於其它各種原理的顯微鏡也不斷問世,使人們認識微觀世界的能力和手段得到不斷提高,其中80年代才出現的掃描隧道顯微鏡(Scanning Tunneling Microscope,STM)是顯微鏡領域的新成員,主要原理是利用了量子力學中的隧道效應。
  近年來,在STM的基礎上又發展出了另一種掃描探針式顯微鏡,原子力顯微鏡(Atomic Force Microscope,AFM)。AFM也是利用細小的探針對樣品表麵進行恒定高度的掃描來對樣品進行“觀察”,但它不是通過隧道電流,而是通過一個激光裝置來監測探針隨樣品表麵的升降變化來獲取樣品表麵形貌的信息,因此,與STM不同,AFM可以用於對不具導電性,或導電能力較差的樣品進行觀察。

 

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