2.1 產脂肪酶天然菌株的篩選
經過初篩、複篩培養，分離出4株活性較高菌株，經過法國梅裏埃微生物鑒定儀鑒定，2株為黴菌，1株為適應弱堿性環境的金黃色葡萄球菌（見圖1A，1B），1株為蠟樣芽孢杆菌。經過富集、初篩、複篩等過程，用溴甲酚紫平板從富含油脂的土壤中篩選得到產脂肪酶的菌株，大部分酶活力經測定後在20 U/mL以內（見表2）。並對其中的4株的酶學特性做了初步研究，4株的作用溫度都較高，在42 ℃左右，一株為產弱堿性脂肪酶，另3株為產弱酸性脂肪酶。
2.2 天然菌基因組提取的優化
所提供的三種提取方法提取全基因，提取效果見圖2。泳道1和3試劑盒法、酚-氯仿法所提取DNA電泳條帶清晰，泳道2煮沸法提取DNA電泳條帶幾不可見，表明試劑盒法、酚-氯仿法方法提取的DNA得率較高，煮沸法提取的DNA得率較低。
2.2 脂肪酶基因的克隆與鑒定
不同方法提取細菌基因組後的PCR擴增電泳見圖3泳道1～3，表明泳道1試劑盒法最佳，泳道2酚-氯仿法次之，泳道3煮沸法提取的基因組模板的PCR產物出現拖尾現象，可見該方法導致基因組降解較劇烈，完整目的基因也因此保留較少。圖3泳道4，為質粒提取試劑盒提取細菌總質粒為模板的PCR產物，無任何擴增條帶出現表明該菌脂肪酶基因位於染色體基因上，質粒不攜帶脂肪酶基因。克隆工程菌重新提取重組質粒，重組質粒用NcoI，XhoI雙酶切後得到脂肪酶基因大小約為900 bp，與預期結果一致，見圖4。
2.3 測序結果分析
通過Blast比對分析，沒有找到與之完全匹配的序列。測序結果與GenBank注冊號EU310372的序列同源性較高。測序結果表明有10處堿基變異，導致三處氨基酸發生改變，即56位由纈氨酸變為精氨酸，183位由亮氨酸變為蘇氨酸，287位由組氨酸變為穀氨酰胺（見圖5）。
2.4 脂肪酶結構預測分析
運用DNA star 7.1軟件分別對兩個脂肪酶蛋白的二級結構進行分析，比較了各類氨基酸數目，螺旋（H=helix）、折疊(E=extend/sheet)、轉角(L=loop)結構的出現的頻率（見表3），雖然有一定的變化，但經SPSS 11.0統計學軟件對兩組酶相應結構類型進行配對t檢驗統計，無顯著性差異（P >0.05)。圖6中箭頭所示為標準序列（A）與克隆脂肪酶氨基酸序列（B）第56位氨基酸發生突變位點導致親水性的顯著提高，183位及其287位氨基酸突變對親水性的影響不顯著。
3 討論
3.1 高產酶菌的篩選及其鑒定
由於含有脂肪酶基因的細菌會進行油脂分解代謝，在高油脂環境中的細菌相應的脂肪酶基因也會有較高的活力及其表達量，故我們選取長期富含油脂的土壤標本分離細菌，這樣可以最大可能地保證待篩選菌株含我們所需高活力脂肪酶基因。實際采集中，從餐飲店後方的清洗處的土壤中分離到較多種類的細菌，結合微生物學對細菌形態描述與菌種鑒定，其中就含有多株產高活力脂肪酶的菌株包括葡萄球菌、芽孢杆菌、假單胞菌、黴菌等。
3.2 脂肪酶基因克隆及酶活力測定
根據GenBank中提交的各類脂肪酶基因，設計引物的數量大於分離到的菌株數量，對分離到的菌株進行不同引物條件的擴增，提高了獲得脂肪酶基因的可能性，達到預期的目的，得到脂肪酶基因。
在提取微生物基因組中我們開始時采用煮沸法。該法操作簡便，成本也很低，但是其基因組得率低，經PCR擴增後得不到產物，尤其對細胞壁較厚的金黃色葡萄球菌等擴增效果不理想，其原因可能是提取的DNA產物不純，混雜有許多蛋白質，導致後續的PCR擴增無明顯結果。因此，試驗中先後采用了基因組提取試劑盒和酚、氯仿方法提取基因組取得了較好的效果。用基因組提取試劑盒提取的DNA得率及其純度都較高，但是成本較高。酚-氯仿法是試驗中常規的一種提取細胞染色體DNA的方法，成本較低，但是步驟繁瑣，耗時很長，DNA經過多種有機溶劑多次抽提損失較大且易被汙染，試劑的有效與否也會產生影響，而且酚和氯仿都對人體有一定的危害[10]。
3.3 克隆脂肪酶二級結構變化討論
克隆脂肪酶的三處氨基酸突變可能是篩選出含該天然酶細菌活性提高、耐受40 ℃高溫以及在高油脂環境依舊水解脂肪的重要原因。而克隆的脂肪酶三處突變導致的結果是親水性的顯著提高，可能有利於提高該酶對脂肪的水解率。
對產脂肪酶的天然菌的分離過程由於是在暑期進行，土壤中油脂來源於生活生產的廢棄用油，沉積過程中油的溫度可高達60 ℃以上，那些不耐高溫且脂肪利用率低的細菌死亡，僅耐高溫且產脂肪酶活力高的菌株得以生存。在這種高溫、高油脂的外界壓力篩選下，微生物的脂肪酶基因極有可能發生突變以適應周圍環境。
本實驗從細菌中克隆的脂肪酶基因經過BLAST比對後無完全相同基因型，極可能是該微生物在高油脂環境的壓力下，其脂肪酶基因發生突變導致其脂肪酶活力的提高，以便於更好利用這一營養物質而能生存下來。後續的研究中我們將進一步在原核表達係統中驗證所分離的脂肪酶基因具有高活力，從而獲得具有較高熱穩定性及其活力的脂肪酶用作各種產品的添加劑及其催化劑。
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