中量提取質粒DNA（CsCl 密度梯度離心法）
李淵越
1. 將菌液倒入裝有 50mL TB 的錐形瓶中，或從培養好的平板上挑取單克隆，錐形瓶置於37℃搖床
350rpm 培養16-20h,至OD600 到10-12。（OD600 到40 為用TBS 培養基在我們的培養條件下所能達到的最高濃度，
在此濃度時，菌處於對數生長期）
2. 將培養好的菌液到入國產 50mL 離心管中，每管不超過45mL。（有實驗表明，若往離心管中裝入超過45mL 的
液體，離心後，液體的終體積仍為45mL。因此，一次不應離超過45mL 的液體，否則將汙染離心機。）
3. 室溫離心 5,000rpm，5min。棄上清，控幹。
4. 加 P1-RNase 至終體積到7mL，震蕩重懸至菌均勻分散。（按該法最多隻能裂解45mL 13OD 的細菌，如需裂解更
多細菌，請按比例增加。否則將導致細菌裂解不完全，反而提到更少的菌。）
5. 加 14mL P2，蓋上蓋子，上下顛倒混勻2min。（該步一定要混勻，以達到將細菌完全裂解的目的。加入P2 後可見溶
液澄清粘稠，該步反應時間不應過久）
6. 加 7mL P3。（P2 和P3 之間反應時間不要超過5min。混勻後可見絮狀沉澱。該步若置於冰上，沉澱效果更好。但位於室溫的反應
以足以達到實驗需要。）用H2O 配平至對稱管重量差<0.1g。
7. 室溫（4 度更好，但沒有必要。）離心，10,000 rpm, 5min。
8. 將上清用濾紙過濾至另一國產的 50mL 管中。加0.6 倍體積的異丙醇，顛倒混勻後室溫（不可置於
4 度。若置於4 度，將會使部分鹽析出）靜置10min。（分子克隆p35）
9. 室溫離心 10,000rpm 15min。
10. 棄上清，在加 1.8mL H2O 溶解完全後，平均分至兩個1.5mL 管中，再分別往每管中加入二分之
一體積的PEG8000，4C 沉澱2 小時。
11. 3,000 rcf 離心3min，棄上清。（可以不要非常完全控幹）
12. 加 1.55mL CsCl 溶液溶解至沉澱完全溶解。10,000 rcf 3min 離心，棄去不溶物質。
13. 往 2mL 超速離心管中加入50ul 2mg/mL EB。加之前用卷紙把槍頭外壁的EB 擦幹。（將外壁的EB 擦幹
是為了防止EB 殘留在離心管的管口。）
14. 將 DNA 移至2mL 超速離心管中,並用H2O 將體積補至2mL。（此時，溶液的密度為3.10g/2mL，共含1.55g CsCl。）
15. 配平至對稱管重量差<0.02g，封口。（該步配平時，可按1ulH2O 重0.001g 來補加H2O 進行配平以縮短時間。）在封口
後，上下顛倒混勻。
16. 打開超速離心機，按 Memu -> Programme -> Plasmid-CsCl -> OK。（該步為149,000rpm 2h 升速max 降速
6。）
17. 按 Vacuum 至真空度<400 後按 Start。（不等真空度至<400 其實也可啟動，但這可能將造成離心機反複升降速，故製
定此規則。）等升至最大轉速後才能離開。（該步為離心機安全操作必須，請務必做到。）
18. 2h 後，取出轉頭，離心管。若轉頭內有液體需將其洗淨，擦幹。（因為此時泄漏的液體含有EB，因此需要
將其洗淨，擦幹。）
19. 先用 8 號針頭在離心管上部插個洞，再用1mL 注射器抽出所需的紅色DNA 條帶至1.5mL 離心管
中。
20. 加入 1mL 水飽和正丁醇，上下顛倒混勻（勿用振蕩器）約20 下。（或更多，使上部液體盡可能變紅。）將
1.5mL 管置於離心機中，按Short 鍵 5 秒，鬆手。棄去上層液體。（離心的目的是為了加速液麵分層，因此
也可省去。）
21. 重複 20 步2-3 遍，至下層看不到紅色後再萃取一遍。（再萃取一遍的目的是為了確保EB 完全去除。）
22. 往溶液中補加等體積的 H2O，平均分成若幹管，使每管終體積為400ul。往每管中分別加入1mL(2.5
倍體積)無水乙醇，顛倒混勻。13,500 rpm 5min 4C。棄上清。（該步的目的是為了除去溶液中殘留的CsCl。）
23. 加 1mL 預冷的70%乙醇洗一遍。13,500 rpm 5min 4C。棄上清。（該步的目的是為了除去21 步中管壁上殘留
的部分含CsCl 的液體。）
24. 加 400ul H2O 或TE 溶解。（對於高拷貝質粒，45mL 菌液將獲得500-1,500ug 左右質粒。）
中量提取質粒DNA（CsCl 密度梯度離心法）
試劑
P1
50mL P1+5mg RNase，4C 保存。
P2
P3
異丙醇
PEG8000
CsCl 溶液
準確稱取31.00gCsCl，加H2O 定容至30.0mL。
2mg/mL EB
水飽和正丁醇
無水乙醇
70%乙醇
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