密碼子的使用
原核和真核生物的基因對同義密碼子的使用均表現非隨機性[171，172]。對E.coli中密碼子的使用頻率進行係統分析得到以下結論[173]：（1）對於絕大多數的簡並密碼子中的一個或兩個具有偏好；（2）某些密碼子對所有不同的基因都是最常用的，無論蛋白質的含量多少，例如CCG是脯氨酸最常用的密碼子；（3）高度表達的基因比低表達的基因表現更大程度的密碼子偏好；（4）同義密碼子的使用頻率與相應的tRNA含量有高度相關性。這些結果暗示,富含E.coli不常用密碼子（表1）的外源基因有可能在E.coli中得不到有效表達。已經證明[174]，微精氨酸tRNAArg(AGG/AGA)是多種哺乳動物基因在細菌中表達的限製因子。因為AGA和AGG在E.coli中不常用。如果共表達編碼tRNAArg(AGG/AGA)的argU(dnaY)基因，就會高水平表達目的蛋白[174]。但利用同方法所進行的另外幾項研究的結果卻不一致[175，176]。其他的研究表明,通過用常用密碼子替換稀有密碼子或與“稀有”tRNA基因共表達可以提高外源基因在E.coli中的表達水平[177，178]。許多研究者對有關密碼子使用模式的進化意義和密碼子使用效果的機製進行了研究，但至今尚未找到協調密碼子的使用和轉錄本翻譯的精確規則。似乎在轉錄本5’末端附近存在稀有密碼子將會影響翻譯效率。另外，基因5’編碼區中GC含量似乎也影響其表達。這在人胸苷酸激酶（TS）中已經得到證明[179]。在不改變所編碼蛋白的前提下，將TS cDNA的第三、四、五密碼子的嘌呤堿基變成胸腺嘧啶，使得TS基因的表達占到E.coli中總蛋白量的25-30%。綜上所述，有許多可變因素可能影響實驗結果，如位置效應、稀有密碼子的群集和mRNA的二級結構等等。
表1 E.coli中不常用的密碼子
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密碼子 氨基酸 |
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AGA,AGG,CGA,CGG Arg
UGU,UGC Cys
AUA Ile
CUA,CUC Leu
CCC,CCU,CCA Pro
UCA,AGU,UCG,UCC Ser
ACA Thr |
l 蛋白質的蛋白酶解
蛋白酶解是一個選擇性的、高度調節的過程，該過程參與許多代謝活動。E.coli在細胞質、細胞外周質、內膜和外膜有許多蛋白酶[180，181]。這些蛋白酶參與宿主的代謝活動，如選擇性地清除異常和錯誤折疊的蛋白。到目前為止，蛋白酶解的機製尚未完全明了，但已有一些策略和方法以減少E.coli中異源蛋白的降解。雖然使得蛋白質不穩定的精確結構特點還不清楚，但是通過係統研究已經明確了一些蛋白不穩定的決定因素。蛋白酶解途徑的“N-末端規則”在E.coli中能夠發揮作用，即蛋白質的穩定性與其氨基端的殘基有關[182]。在E.coli中，Ｎ－末端Arg、Lys、Leu、Phe、Tyr和Trp的半衰期為２分鍾，而除脯氨酸外的其他氨基酸的半衰期均超過10小時。有研究表明，在多肽的第二位帶有較小側鏈的氨基酸有利於甲硫氨酸氨肽酶催化的N-末端甲硫氨酸的去除，從而暴露出位於第二位的亮氨酸，使得該蛋白不穩定[183]。蛋白質的第二個決定因素是位於近氨基端的特異性內源賴氨酸殘基[142，143]。該殘基是多遍在蛋白鏈的受體，多遍在蛋白鏈在真核細胞中有利於遍在蛋白依賴的蛋白酶對蛋白質的降解。有趣的是在一個多遍在蛋白中，它的兩個決定簇可以位於不同的亞基上，卻能靶向同一個蛋白進行加工[184]。 氨基酸成分和蛋白質不穩定性的另一個關係體現在PEST假說中[185]。根據對短壽命真核蛋白的統計分析，蛋白質如果富含Pro、Glu、Ser和Thr的區域，且在該區域附近有某些特定的氨基酸，則該蛋白就會不穩定。這些PEST結構域的磷酸化導致鈣的結合能力提高，從而利於鈣依賴性蛋白酶對蛋白質的降解。這提示可以在缺乏PEST蛋白裂解係統的E.coli中表達PEST富含蛋白。
減少E.coli中重組蛋白裂解的策略有以下幾種：（1）將蛋白質靶向細胞周質或培養基[145，186]；（2）在較低的溫度下培養細菌[187]；（3）選用蛋白酶缺陷的菌株[188]；（4）構建N-末端或C-末端融合蛋白[186]；（5）將目的基因多拷貝串聯[188]；（6）與分子伴侶共表達[189]；（7）與T4 pin基因共表達[190]；（8）替換特定的氨基酸殘基以消除蛋白酶裂解位點[191]；（9）改善蛋白質的親水性[192]；（10）優化培養條件[193]
融合蛋白表達
在E.coli中表達外源蛋白，尤其是真核蛋白時，蛋白質的穩定性是經常遇到的問題。最近幾年，眾多巧妙的蛋白質——融合係統的發展，為E.coli中高效表達和純化重組蛋白提供了極大方便。融合表達具有多方麵的優點：如防止包涵體的形成，促進蛋白質的正確折疊，限製蛋白酶解和利於純化[159，194]。
Uhlen和其同事[195]利用葡萄球菌A蛋白和合成的結構域（Z）開發了一種多功能的融合伴侶，除了能夠作為純化標記外，A蛋白組分還作為一種可溶性伴侶促進蛋白質的折疊，A蛋白信號肽的存在可使表達蛋白分泌到培養基中。另一個融合伴侶是鏈球菌G蛋白（SPG），它是一種細菌胞壁蛋白，在其氨基端具有分離的白蛋白結合區，在OH端具有免疫球蛋白IgG結合區[196]。最小的白蛋白結合區由來源於SPG的46個氨基酸殘基組成，作為親和純化標記純化cDNA編碼的蛋白。如果將A蛋白和SPG結構域聯合組成三聯融合蛋白，則為純化提供了更為廣泛的選擇，可以更進一步防止蛋白酶解。SPG-白蛋白的一個重要應用是其能夠穩定哺乳動物外周循環中的短壽命蛋白，這一效應是通過SPG結構域與一種長壽命蛋白——血清白蛋白的結合來介導的[197]。
最近又建立了一種更為複雜和巧妙的親和係統[198]。這種多元係統利用了七種不同的親和標記，從而允許使用多種結合和洗脫條件，為重組蛋白的生產、檢測和純化提供了一個有力的工具。
使用基因融合表達係統在E.coli中表達外源基因已經越來越受歡迎。這在很大程度上歸因於融合係統能夠產生大量的可溶性的融合蛋白。穀胱甘肽Ｓ－轉移酶（GST）、麥芽糖結合蛋白（MBP）以及硫氧還蛋白（Trx）均已經被證實能非常成功地生產正確折疊、有生物活性的蛋白質，能明顯提高在E.coli細胞質中產生的融合蛋白的可溶性，並能抑製包涵體的形成[159，194]。其中每一種都備有方便的純化方法，可將融合蛋白與細胞汙染物分開。已經建立了多種對融合蛋白進行位點特異性裂解的方法，方法的選擇通常由特定蛋白的組成、序列及物理性質決定[199]。可采用諸如溴化氰（Met↓）、羥胺（Asn↓Gly）、等試劑或低pH(Asp↓Pro)來進行融合蛋白的化學裂解。化學裂解的方法較便宜而且有效，甚至常常可以在變性的條件下裂解非變性不能溶解的蛋白質。但有時目的蛋白中存在裂解位點，或因發生副反應而導致對蛋白質進行不必要的修飾，從而阻礙了它們的應用。作為一個備選方案，酶解的方法相對來說其反映條件較溫和，更重要的是，普遍用於此用途的蛋白酶都具有高度的特異性。其中常用的酶有：Xa因子、凝血酶、腸激酶、凝乳酶和膠原酶。所有這些酶都具有較長的底物識別序列，從而降低了蛋白質中其他無關部位發生斷裂的可能性。在上述提及的各種酶中，Xa因子和腸激酶應用最多，因為它們切割各自的識別序列的羧基端，使帶有天然氨基酸的被融合部分得以釋放。
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