翻譯水平的調控
1. mRNA翻譯起始
有關轉錄過程的大量知識使得能夠在不被附近核苷酸序列影響的情況下，在表達盒中使用原核啟動子[87]。對於決定蛋白質合成的起始因素，雖然尚不能完全弄清楚，但目前已經明白，mRNA轉錄本5’末端的獨特結構是mRNA翻譯起始效率的最主要決定因素。至今還沒有發現通用的有效起始翻譯的共同序列。已知序列的絕大部分（91%）E.coli基因的翻譯起始區均含有起始密碼子AUG，GUG的利用率為8%，而UUG的利用率則為1%[88,89]。Shine-Dalgarno(SD)位點在翻譯起始階段與16S rRNA的3'端相互作用。SD與起始密碼子間的距離約為5-13bp，這一距離影響翻譯起始的效率[90]。人們對此進行了深入的研究，以確定最佳的SD區序列和SD與起始密碼子之間的最有效間隔[91,92]。Ringquist等[93]研究了RBS的翻譯功能，得出了以下結論：（1）在間隔相同的情況下，UAAGGAGG的SD序列比AAGGA的SD序列能使蛋白質的產量提高3-6倍；（2）對於同一SD序列，存在一最佳的間隔。AAGGA的間隔為5-7個核苷酸，而UAAGGAGG的間隔為4-8個核苷酸；（3）對於同一SD序列，有一翻譯所必需的最小間隔。AAGGA的最小間隔為5個核苷酸，而UAAGGAGG的最小間隔為3-4個核苷酸。這些間隔提示，在16S rRNA的3’末端和結合於核糖體P位點的fMet-tRNAf的反義密碼子之間存在精確的物理關係。
在mRNA的翻譯起始區的二級結構在決定基因表達效率方麵具有重要作用[94,95,96]。如用一發卡結構封閉SD區和/或AUG密碼子就會阻止其與30S核糖體亞單位的結合，從而抑製翻譯[97]。已經設計了幾種不同的策略以使mRNA形成二級結構的可能性最小。提高RBS中A、T殘基的豐度能增強某些基因的表達[98]。同樣地，突變SD區上遊或下遊的某些特定核苷酸就會抑製mRNA二級結構的形成和提高翻譯效率[99]。另一途徑得益於在E.coli中自然發生的一種翻譯偶聯現象[100]。翻譯偶聯的機製已被用來解釋來自多順反子mRNA的不同基因的並列表達。已經證明，當galK與上遊基因偶聯翻譯時，經修飾的gal強啟動子能夠指導半乳糖激酶的高水平合成。這提示即使很弱的RBS，如果與核糖體結合也能非常有效。這種調節機製有可能在蛋白質超量生產生物技術中發揮重要作用。事實上，翻譯偶聯已經被廣泛用於不同基因的高效表達。
除了SD區與16S rRNA結合之外，mRNA和核糖體的其他相互作用也參與翻譯的起始。如核糖體S1蛋白直接參與30S亞基對mRNA的識別和結合[101]。
2．翻譯增強子
已經在細菌和噬菌體中鑒定了一些在E.coli中顯著增強異源基因表達的序列。Olins等從T7噬菌體基因10前導序列（ g10-L）中鑒定了一9bp的序列，該序列似乎能替代有效的RBS。同SD共有序列相比，g10-L能使多種基因的表達水平提高40-340倍[102]。若將其置於合成SD序列的上遊，按照β-半乳糖苷酶的活性與LacZ mRNA的水平來估計，g10-L序列能使 LacZ的翻譯水平提高110倍[103]。另外的研究小組在mRNA的5’非翻譯區（UTR）鑒定了一U富含序列，該序列同樣具有翻譯增強子活性。McCarthy等[104]在 E.coli atpE基因中緊接於SD位點下遊鑒定一類似區域。有文獻用一30bp的序列超量產生IL-2和IFN-β[105]。另有人證明在編碼RNase D的rnd mRNA SD位點的上遊，有一U8序列對該mRNA的有效翻譯是必需的。缺失這一區域會顯著降低翻譯，但不影響rnd mRNA的水平和轉錄起始位點[106]。研究證明這些類似序列的靶位是30S核糖體亞單位的S1蛋白[107]。在另一項有趣的研究中，研究者證明在緊接起始密碼子下遊的序列在翻譯起始過程中發揮重要作用。位於T7基因0.3編碼區+15至+26之間或位於T7基因10編碼區+9至+21之間被稱做下遊框（DB）的特定區域具有翻譯增強子的功能。DB區與16S rRNA的1469-1483核苷酸互補，這一區域稱做反下遊框（ADB）。缺失DB將廢除翻譯活性。相反，如果優化DB和ADB之間的互補則會以最高水平表達dhfr融合基因。有趣的是，如果將DB從起始密碼子的上遊移到SD序列的位置，DB則失去功能。DB序列存在於一些E.coli和噬菌體基因中[108,109]。
上述這些發現充分證明，除了SD位點和起始密碼子以外，mRNA中的其他序列對於有效的翻譯也是重要的。盡管其精確的機製還不太清楚，但有可能利用翻譯增強子來達到超量表達蛋白質的目的。
3．mRNA的穩定性
mRNA的快速降解勢必影響蛋白質的產生。因此在這一部分重點闡述決定mRNA穩定性的因素，這將在E.coli高效表達外源基因中有實際應用。在E.coli中有多種不同的RNase參與mRNA的降解，其中包括內切核酸酶（RNase E, RNase K和RNase III）和3’外切核酸酶（RNase II和多聚核苷酸磷酸化酶[PNPase]），目前尚未在原核細胞中發現5’外切核酸酶[110]。mRNA的降解並非由非特異性的外切核酸酶隨機剪切而引起，因為在mRNA的長度和半衰期之間並沒有反向相關性[111]。已經證明，在E.coli中有兩類保護性元件能夠穩定mRNA。一類由mRNA的5’UTRs中的序列組成[112]；另一類由3’UTRs和多順反子間區的發卡結構組成[113]。其中一些元件與異源mRNA融合後起穩定劑作用，但隻在嚴格的條件下如此。例如，噬菌體T4基因32的5’UTR在T4噬菌體感染的細胞中延長非穩定mRNA在E.coli中的半衰期[114]。革蘭氏陽性菌如金黃色葡萄球菌和枯草杆菌的紅黴素抗性基因（erm）編碼的mRNA 5’UTR含有穩定元件。但ermC和ermA 5'UTRs的穩定作用需要由抑製翻譯和引起核糖體失控的抗生素來誘導[115]。同樣，噬菌體λPL對於λPL-trp轉錄本的穩定作用需要λ噬菌體的感染[116]。與此相反，E.coli ompA轉錄本能夠在細胞快速增殖的正常情況下延長一係列異源mRNA在E.coli中的穩定性[117]。Emory等證明，在接近或緊接ompA 5'UTR的5’末端存在發卡結構對於其穩定效果是必需的。而且可以通過在5'末端添加發卡結構來延長在正常情況下不穩定的mRNA的半衰期[118]。這樣看來，對異源基因添加ompA 5'穩定元有可能提高E.coli中的基因表達。另一類由3’UTR組成的mRNA保護性元件能夠形成發卡結構，因而能夠阻斷外切核酸酶從3’末端對轉錄本的降解[113]。Wong和Chang[119]在蘇雲金杆菌的晶體蛋白基因的轉錄終止子中鑒定了一個這樣的元件。將該“陽性反調節子”與地衣杆菌的青黴素酶基因(penP)的3’末端和人IL-2 cDNA融合，能夠延長mRNA的半衰期，且提高了相應多肽在枯草杆菌和E.coli中的產量。然而，同某些5’穩定元一樣，這類3’反向調節子不可能作為一個通用的mRNA穩定元。而且有證據表明，可以通過選用缺乏某些特定RNase如RNaseII或PNPase的宿主菌來提高基因的表達。這同樣並非一有效途徑。因為缺乏RNaseII或PNPase與RNase過量表達一樣，對於E.coli整體mRNA的平均半衰期並無多大影響。而且缺乏RNaseII或PNPase的菌株常常是不穩定的[120,121]。
4．翻譯終止
在mRNA中存在終止信號是翻譯終止過程必不可少的。除了三個終止密碼子UAA、UGA、
和UAG外，翻譯終止這一複雜事件還包括核糖體、mRNA和終止位點的幾種釋放因子的特異相互作用[122]。在E.coli中，RF-1在終止密碼子UGA處終止翻譯；RF-2在UAA密碼子處終止翻譯[123]。最近還克隆了另外一個因子RF-3[124]。
在設計表達載體時，通常插入三個終止密碼子以防止核糖體的跳躍。在E.coli中偏向於使用UAA密碼子[125]。一項對於2000多個E.coli基因的統計分析表明，在終止密碼子和緊接三聯體的核苷酸序列中存在局部非隨機性[126]。同時他們還利用體內終止試驗測定12個可能的四核苷酸“終止信號”（UAAN、UGAN、UAGN）的終止力量。在體內終止試驗中，通過其與框架移位的競爭測定其終止效率。轉錄效率依據終止密碼子和第四個核苷酸而有顯著的差異，這種差異從80%（UAAU）到7%（UGAC）不等。這些研究表明，緊接終止密碼子後的核苷酸特性強烈地影響E.coli中的翻譯終止效率[127]。UAAU是E.coli中最有效的轉錄終止序列。此外，終止密碼子5’末端的鄰近序列也影響終止的效率。因此，新生肽中倒數第二位（-2位）C-末端氨基酸殘基的電荷和疏水性能引起多達30倍不同的UGA終止效率，而在UAG位的終止對於-2位氨基酸殘基的特性不敏感[128]。對於-1位，α-螺旋、β-鏈和回轉傾向是UGA終止中的決定因素[129]。
上一篇：在大腸杆菌中高效表達外源蛋白的策略（二）
下一篇：在大腸杆菌中高效表達外源蛋白的策略（四）
