一、細菌的培養和收集
將含有質粒pBS的DH5α菌種接種在LB固體培養基(含50μg/ml Amp)中,
二、質粒DNA少量快速提取
質粒DNA小量提取法對於從大量轉化子中製備少量部分純化的質粒DNA十分有用。這些方法共同特點是簡便、快速，能同時處理大量試樣,所得DNA有一定純度,可滿足限製酶切割、電泳分析的需要。
（一）、煮沸法
1、將1.5ml培養液倒入eppendorf管中,
2、棄上清，將管倒置於衛生紙上幾分鍾，使液體流盡。
3、將菌體沉澱懸浮於120ml STET溶液中, 渦旋混勻。
4、加入10ml新配製的溶菌酶溶液(10mg/ml), 渦旋振蕩3秒鍾。
5、將eppendorf管放入沸水浴中,50秒後立即取出。
6、用微量離心機
7、用無菌牙簽從eppendorf管中去除細菌碎片。
8、取20ml進行電泳檢查。
[注意] 1. 對大腸杆菌可從固體培養基上挑取單個菌落直接進行煮沸法提取質粒DNA。
2. 煮沸法中添加溶菌酶有一定限度,濃度高時,細菌裂解效果反而不好。有時不同溶菌酶也能溶菌。
3. 提取的質粒DNA中會含有RNA,但RNA並不幹擾進一步實驗,如限製性內切酶消化,亞克隆及連接反應等。
（二）、堿法
1、取1.5ml培養液倒入1.5ml eppendorf管中,
2、棄上清,將管倒置於衛生紙上數分鍾,使液體流盡。
3、菌體沉澱重懸浮於100μl溶液Ⅰ中(需劇烈振蕩),室溫下放置5-10分鍾。
4、加入新配製的溶液Ⅱ200μl, 蓋緊管口，快速溫和顛倒eppendorf管數次,以混勻內容物(千萬不要振蕩),冰浴5分鍾。
5、加入150μl預冷的溶液Ⅲ,蓋緊管口，並倒置離心管，溫和振蕩10秒,使沉澱混勻,冰浴中5-10分鍾,
6、上清液移入幹淨eppendorf管中,加入等體積的酚/氯仿(1:1),振蕩混勻,
7、將水相移入幹淨eppendorf管中,加入2倍體積的無水乙醇,振蕩混勻後置於
8、棄上清,將管口敞開倒置於衛生紙上使所有液體流出,加入1ml 70％乙醇洗沉澱一次,
9、吸除上清液,將管倒置於衛生紙上使液體流盡,真空幹燥10分鍾或室溫幹燥。
10、將沉澱溶於20μl TE緩衝液(pH8.0，含20μg /ml RNaseA)中，儲於
[注意] 1. 提取過程應盡量保持低溫。
2. 提取質粒DNA過程中除去蛋白很重要,采用酚/氯仿去除蛋白效果較單獨用酚或氯仿好,要將蛋白盡量除幹淨需多次抽提。
3. 沉澱DNA通常使用冰乙醇,在低溫條件下放置時間稍長可使DNA沉澱完全。沉澱DNA也可用異丙醇(一般使用等體積),且沉澱完全,速度快,但常把鹽沉澱下來,所以多數還是用乙醇。
（三）、Wizard少量DNA 純化係統
Promega公司的Wizard少量DNA純化係統可快速有效的抽提質粒DNA,整個過程隻需15分鍾。提取的質粒可直接用於DNA測序、酶切分析和體外轉錄等。
該係統中所含試劑和柱子可以用於50次1-3ml質粒培養液的分離和純化，試劑包括10ml細胞懸浮液，10ml細胞裂解液；10ml中和液，50ml Wizard少量DNA純化樹脂，50ml柱洗液（使用前加95%乙醇至120ml )和50支Wizard微型柱。
1、1-3ml過夜培養細胞液
2、去除上清液，菌體細胞懸浮於200μl 細胞懸浮液中,充分混合,並移入eppendorf管中。
3、加200μl 細胞裂解液, 顛倒離心管數次,直到溶液變清亮。
4、加200μl 中和液,顛倒離心管數次。
5、4℃下
6、加1ml Wizard少量DNA 純化樹脂,顛倒離心管數次以充分混勻。
7、取一次性注射器, 取出注塞,並使注射筒與Wizard微型柱連接,用移液槍將上述混合液加入注射筒中,並用注塞輕推,使混合物進入微型柱。
8、將注射器與微型柱分開,取出注塞, 再將注射筒與微型柱相連,加入2ml柱洗液,並用注塞輕推，使柱洗液進入微型柱。
9、取出微型柱置於eppendorf管中,離心2分鍾以除去微型柱中的柱洗液。
10、將微型柱放在一個新eppendorf管中，加50μl TE(或水)於微型柱中，靜止1分鍾後，
11、丟棄微型柱，將eppendorf管中的質粒DNA貯於
[注意] 樹脂使用前應充分混勻,如有結晶,可將樹脂用25
三、質粒DNA的大量提取和純化
在製作酶譜、測定序列、製備探針等實驗中需要高純度、高濃度的質粒DNA,為此需要大量提取質粒DNA。大量提取的質粒DNA一般需進一步純化,常用柱層析法和氯化絕梯度離心法。
（一）、堿法
1、取培養至對數生長後期的含pBS質粒的細菌培養液250ml，
2、將細菌沉澱重新懸浮於50ml用冰預冷的STE中（此步可省略）。
3、同步驟1方法離心以收集細菌細胞。
4、將細菌沉澱物重新懸浮於5ml溶液I中,充分懸浮菌體細胞。
5、加入12ml新配製的溶液II, 蓋緊瓶蓋,緩緩地顛倒離心管數次,以充分混勻內容物,冰浴10分鍾。
6、加9ml用冰預冷的溶液III, 搖動離心管數次以混勻內容物,冰上放置15分鍾,此時應形成白色絮狀沉澱。
7、4℃下
8、取上清液,加入50ml RNA酶A(10mg/ml),
9、加入等體積的飽和酚/氯仿,振蕩混勻,
10、取上層水相, 加入等體積氯仿,振蕩混勻,
11、取上層水相,加入1/5體積的4mol/L NaCl和10% PEG(分子量6000), 冰上放置60分鍾。
12、4℃下
13、真空抽幹沉澱，溶於500ml TE或水中。
[注意] 1. 提取過程中應盡量保持低溫。
2. 加入溶液II和溶液III後操作應混和,切忌劇烈振蕩。
3. 由於RNA酶A中常存在有DNA酶,利用RNA酶耐熱的特性,使用時應先對該酶液進行熱處理(
（二）、Wazard大量DNA純化係統
堿法大量提取DNA往往需要很長的時間.Promega公司的Wiazrd大量DNA純化係統既簡單又快速,隻需要離心和真空抽幹,這個係統可以從500ml培養液中在3小時以內獲得1mg以上的高質量的質粒DNA(200-20000bp)。該係統不需要酚和氯仿抽提,純化後的DNA溶於水或TE緩衝液中，不含任何鹽份，可以直接用於DNA序列分析和酶切反應，也可以用於在核酸酶抑製劑（如RNasin）存在的條件下進行體外轉錄反應等。
該係統中含有的試劑和柱子可以用於10次100-500ml質粒培養液的分離和純化,試劑包括: 150ml 細胞懸浮液，150ml 細胞裂解液，150ml 中和液，100ml Wizard 大量DNA純化樹脂，125ml Wizard柱子洗脫溶液和10支Wizard帶有存儲離心管的柱子。
1、100-500ml細胞培養液置離心管中, 22
2、加15ml細胞裂解溶液並輕輕混合,可以反複倒置混合,但不能用渦旋振蕩,細胞裂解完全時,溶液會變清,這一步需要20分鍾。
3、加15ml中和溶液,立即反複倒置離心管數次，並使之混勻。
4、14000g,22
5、小心地將上清液吸出並移至一個新離心管中。
6、加0.5倍體積的異丙醇,混合均勻,
7、棄上清,懸浮DNA沉澱於2ml TE緩衝液中。這一步中也許有的沉澱不能溶解。
8、加10ml Wizard大量DNA純化樹脂溶液, 並渦旋混合。
9、每一個樣品,使用一支Wizard大量柱子,柱子的頭插在真空器上(Promega產品,與此配套)。
10、將樹脂/DNA混合液轉入柱子中,真空抽取樹脂/DNA混合液。
11、將樹脂/DNA混合液抽幹後,加13ml柱子洗脫溶液至離心管中, 對管底部的樹脂/DNA進行洗脫(柱子一邊旋轉一邊加入洗脫液)，並加入柱子中。
12、真空抽幹所加入的洗脫。
13、再加12ml柱子洗脫液進柱子並抽幹。
14、加入5ml 80％乙醇漂洗柱中的樹脂, 柱子真空抽幹後將柱子放入用戶提供的離心管中,2500rpm(
15、取出柱子，真空抽幹5分鍾,再將柱子放入係統中所提供的離心管中，2500rpm(
16、在柱子中加入1.5ml 65
17、取出柱子,離心管中溶液即為提取的質粒DNA,可以直接放在離心管中,蓋上蓋子，儲存在
[注意] 1. 在使用之前,係統所提供的柱子洗脫液按1:1加入125ml 95％乙醇。
2. 純化樹脂必須混勻後再用.
（三）、Sephrose 2B柱純化質粒DNA
堿法提取的質粒DNA即使用RNA酶處理,仍會含有少量RNA。當有些試驗需無RNA汙染的DNA製品時,則需進行進一步純化。一般常用Sepharose 2B或Sepharose 4B進行純化,該方法具有快速,條件溫和,重複性好,載體物質可以再利用等優點,因而已廣泛用於質粒DNA純化。
1、將Sepharose 2B經含0.1% SDS的TE（pH8.0）平衡後上柱。
2、將至多1ml的DNA溶液鋪在Sepharase 2B柱上。
3、待DNA溶液完全進入柱內後立即在柱的上部連接含有0.1% SDS的TE(pH8.0)貯液瓶。
4、以1ml流出液為1份進行收集。
5、對每一管測定其OD260值,以確定哪些管中含有質粒DNA。通常質粒DNA在柱上流出的第一個峰中。
6、合並所有含質粒的洗脫液,用等體積的酚/氯仿(1:1)抽提,
7、加入2倍體積的冰冷無水乙醇，
8、沉澱加70%乙醇洗滌,
9、沉澱真空抽幹,重新溶於TE或無菌水中。
[注意] 在裝柱過程中,要防止柱床中出現斷裂或氣泡現象,要使界麵保持平整。對新裝成的柱,應用含0.1% SDS的TE平衡, 以使柱內的凝膠均勻。
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