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食源性致病菌檢測技術(11)



錄入時間:2011-9-2 9:51:16 來源:食品夥伴網

 

致瀉性大腸埃希氏菌

    致瀉性大腸埃希氏菌能使人類致病,監診表現主要為嚴重腹瀉,多數表現為敗血症。根據血清型別、毒力和所致臨床症狀可分為產腸毒素性大腸埃希氏菌(ETEC)、腸致病性大腸埃希氏菌(EPEC)、腸侵襲性大腸埃希氏菌(EIEC)、腸出血性大腸埃希氏菌(EHEC)以及腸粘附性大腸埃希氏菌(EAEC)五類。 

1.常規分離鑒定技術:按照GB/T4789-2003方法進行

    酶聯免疫法(ELISA):應用O157H7多克隆抗體包被酶標板,加入適當稀釋與處理的糞便標本後,再與過氧化物酶標記的抗O157H7抗體結合,加底物顯色,此法可直接檢測糞便中O157H7大腸埃希氏菌抗原,結果與細菌培養法一致。 

    免疫磁珠分離法(IMS):用免疫磁分離法檢測牛糞便和食品標本的大腸杆菌O157H7。可提高了大腸杆菌O157H7感染病例的檢出率,與PCR符合率高。 

2.快速酶觸反應:大腸埃希氏菌具β-葡萄糖醛酸酶,但以O157H7為代表的腸出血性大腸埃希氏菌(EHEC)卻不具此酶。 

    毒素及毒力因子檢測:包括LTSTHlySLTStxEaeAVTEAST等,過去多用動物或細胞培養測定,現可用其單抗以多種免疫學手段檢出,也可用基因探針技術或PCR等分子生物學技術檢測。同時檢測HlySLT基因,能快速檢測和鑒定EHEC菌株,並與EPEC區分開來。 

    基因探針和PCR技術:國內徐建煙根據溶血素hlyAB基因序列設計了鑒定EHEC的特異DNA探針,敏感性特異性達99%Fortin將套式PCR技術和熒光探針技術相結合來檢測O157,該方法不僅可以鑒定與O157抗血清有交叉反應的菌株,而且靈敏度高,可檢測牛奶和蘋果汁中102CFU/ml,的細菌,如果先進行6h增菌,可檢測1CFU/ml的細菌。

基因芯片:Chizhikov6個編碼大腸杆菌細菌抗原和毒力的特異基因探針(EaeASltISltIIFliCRfbEIpaH)點樣在玻片上,取多重PCR擴增產物與之雜交,用於同時檢測和鑒定食物中毒相關的腸道病原體,該芯片可同時檢測15種沙門菌、誌賀菌和大腸杆菌的毒力因子。 

    細胞粘附試驗:傳統的細胞粘附試驗是檢測EIEC的標準方法。方法為在24孔板的孔中圓形玻片上培養的HEP-2細胞單層,生長致50%;待檢菌以L肉湯培養,37,靜止培養16h;每孔加入20ul菌液(含2×107個菌),置375%CO2溫育3h,培養液中含1%α-甲基-D-甘露醇;Hanks平衡鹽溶液洗培養板3次;70%乙醇固定,10%Giema染色,取出圓形玻片,置載玻片上,油鏡觀察。 

3.分子流行病學分型方法

    血清型分型技術:包括OKHF四種抗原。O抗原共171種,其中162種與腹瀉有關,是分群的基礎。K抗原103種。從病人新分離的大腸埃希氏菌多有K抗原。根據耐熱性等不同,K抗原分為LAB三種,其中LB不耐熱,有60種。F抗原至少有5種,與大腸埃希氏菌的粘附作用有關。血清型的表示方式可按OKH排列,例如OKHO111K58B4):H2OKO8K88OHO168H27 

    脈衝場電泳(PFGE)分型:用核糖體分型和脈衝腸電泳技術,對急性分泌型腹瀉病人中分離的ETEC病原菌分析,血清型相同的ETEC菌株具有遺傳異質性,不同血清型的ETEC菌株其PFEG型一致。美國國家公共衛生實驗室已完成了PFGE的標準化流程的製定。 

    隨機引物擴增DNA多態性(RAPD)和擴增片段長度多態性(FAFLP)分析分型技術:用隨機擴增多態性DNA技術(RAPD)分析,發現具有相同表型特征的ETEC菌株,用分子生物學分型方法能揭示菌株間的差異,這些差異往往在不能在對ETEC的表型中顯示出來。有學者認為FAFLPPFGE具有更高的鑒定能力,擴增片段可精確到±1bp

噬菌體分型:目前,通過對噬菌體感受性的不同,已獲得80餘種噬菌體型。

 

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