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包涵體表達的蛋白的複性(四)



錄入時間:2011-9-1 17:01:01 來源:中國生命科學實驗

幾個複性的實例:

1、MHCII JBC 269(47):1994

增溶:16-40mg Protein,8MGdnHCl,16-32mM DTT,1mM EDTA,50mM Tris pH8.037度1hr.

複性:8-16fold dilution to1-5mg/ml Protein.

2、增溶:10mM DTT,0.1%SDS,25mM Tris,200mMGlucine pH8.5.

複性:10倍稀釋到10mM DTT,2mMDodOMalt(dodecyl-beta-D-maltoside),150mMNaCl,10mMTris pH8.0.對起始緩衝液密閉透析16hr,開口透析8hr,對150mMNaCl,10mM Tris pH8.0透析48hr。

3、Bovine Prethrombin-2,JBC 270(1):1990 四對二硫鍵。

增溶:7M GdnHCl,10mMTris pH8.0,1mM EDTA 4mg/ml.

複性:稀釋到100mM Na2HPO4,2 mM EDTA,0.1% PEG,0-4M GdnHCl,0.1 mM GSSG,0.2 mM GSH,pH7.4,0.025 mg/ml Protein.RT 24hr.對4L 25mM sodiumphosphate,2mM EDTA,0.1%PEG,pH7.4 透析3次,溫度4度。

純化:

一般說來,複性液的體積較大,為了減少處理體積,在進行柱純化以前可以先進行硫酸銨沉澱,沉澱在低速離心收集後複溶的鹽濃度較高,可以直接進行HIC純化,目標峰經適當稀釋後(cond<5mS/cm)進行IEX純化,然後通過SEC脫鹽,更換緩衝液,除菌過濾後,在質量合格的情況下便可以進入製劑階段。

當然在複性濃度較高的情況下,也可以直接將複性液進行IEX純化,優點是在純化的同時進行體積的濃縮,為以後的精製創造條件。

從生產的角度看,由於每增加一步純化工序便降低很多收率,所以可過兩到三次柱純化,工藝越簡單越有利於收率的提高。當然這隻是一個一般的原則,對於純度要求較高的產品如重組人白蛋白,不得不進行多次純化。

 

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