硝化細菌的分離、培養和觀察

硝化細菌是生物界中一類特殊的生產者，能進行硝化作用參與氮素的轉化

 

儀器與試劑：

恒溫箱、高壓滅菌鍋、天平、量杯、玻棒、大試管、三角瓶（250毫升）、顯微鏡、白瓷板、α—萘胺試劑、二苯胺試劑、醋酸、磺胺酸，革蘭氏試劑、PH試紙、(NH4)2SO4、NaH2PO4、K2HPO4、Na2CO3、MnSO4•4H2O、MgSO4•7H2O、NaNO2、NaOH(0.1N)、HCl(0.1N)、濃H2SO4、蒸餾水。

 

實驗過程：

（一）   配製硝化細菌培養液：

NaNO2	1g
MgSO4·7H2O	0.03g
MnSO4·4H2O	0.01g
K2HPO4	0.75g
Na2CO3	1g
NaH2PO4	0.25g
蒸餾水	1000ml

培養液pH值用0.1NNaOH或0.1NH4Cl調至7.0～7.2。

 

（二）滅菌

將配製好的培養液分裝在大試管中，每管約15毫升，堵上包有紗布的棉塞，放在高壓滅菌鍋中，15磅30分鍾滅菌備用。

 

（三）樣品采集：

采用公園下層湖水約100毫升即可。

 

（四）接種：

用吸管吸取樣品，每支試管接1～2毫升樣品。

 

（五）培養：

置於28～30℃恒溫箱中靜置7～10天。

 

（六）結果測定：

 

1、配製試劑：

（1）α—萘胺試劑的配製：用天平稱取α—萘胺5克於100毫升醋酸(5N)中，用玻棒攪拌溶解。

（2）二苯胺試劑的配製：用天平稱取0.5克二苯胺溶於100毫升濃濃H2SO4中，再加入20毫升蒸餾水中攪拌稀釋。

 

2、NO2-的檢驗：

在瓷盤小孔內各加入1滴α-萘胺試劑，然後加少許試驗液，變紅色的為(+)，未變色(黃色)的為(-)。

 

3、NO3-的檢驗：

（1）先除去培養物中的NO2-：方法是在培養物中加入醋酸5～8滴，使之酸化，再加入數粒磺胺酸，當停止放出氣體時，再加入一粒磺胺酸，此過程中NO2-轉化為N2而逸出。用α-萘胺試劑檢查，如不出現紅色，證明培養物中不含NO2-。

（2）檢驗NO3-的產生：方法是吸取培養物少許於白瓷板凹窩中，滴入二苯胺試劑，如有藍色出現，即證明有NO3-的積累。

 

（七）富集培養：

將測定為(+)的菌液接入裝有100毫升培養液的250毫升三角瓶中(培養液已滅過菌)，置28～30℃恒溫箱中培養，待生長後測定結果為(+)再接另瓶培養液中進行培養。如此經多次移接，可使培養液的亞硝化細菌和硝化細菌逐步增多。

 

（八）觀察：

將菌液製成塗片，經革蘭氏染色後，顯微鏡下觀察菌體形態。