五、包涵體的純化
複性以後的蛋白質的純化策略與可溶性蛋白質相似，這裏不再贅述。（注：當然也可以先純化然後再複性———一般多采用凝膠柱，或者純化與複性同步進行———比如柱上複性。）
2、綜述
蛋白的複性是一個世界性的難題，沒有通用的方法，甚至沒有靠得住的規律，隻能試。
包涵體表達的蛋白的複性包涵體表達的蛋白的複性
包涵體：
包涵體是指細菌表達的蛋白在細胞內凝集，形成無活性的固體顆粒。
包涵體的組成與特性：
一般含有50%以上的重組蛋白，其餘為核糖體元件、RNA聚合酶、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，環狀或缺口的質粒DNA，以及脂體、脂多糖等，大小為0.5-1um，難溶與水，隻溶於變性劑如尿素、鹽酸胍等。
包涵體的形成：
主要因為在重組蛋白的表達過程中缺乏某些蛋白質折疊的輔助因子，或環境不適，無法形成正確的次級鍵等原因形成的。
1、表達量過高，研究發現在低表達時很少形成包涵體，表達量越高越容易形成包涵體。原因可能是合成速度太快，以至於沒有足夠的時間進行折疊，二硫鍵不能正確的配對，過多的蛋白間的非特異性結合，蛋白質無法達到足夠的溶解度等。
2、重組蛋白的氨基酸組成：一般說含硫氨基酸越多越易形成包涵體，而脯氨酸的含量明顯與包涵體的形成呈正相關。
3、重組蛋白所處的環境：發酵溫度高或胞內pH接近蛋白的等電點時容易形成包涵體。
4、重組蛋白是大腸杆菌的異源蛋白，由於缺乏真核生物中翻譯後修飾所需酶類，致使中間體大量積累，容易形成包涵體沉澱。因此有人采用共表達分子伴侶的方法以增加可溶蛋白的比例。
包涵體表達的有利因素：
1、可溶性蛋白在細胞內容易受到蛋白酶的攻擊，包涵體表達可以避免蛋白酶對外源蛋白的降解。
2、降低了胞內外源蛋白的濃度，有利於表達量的提高。
3、包涵體中雜蛋白含量較低，且隻需要簡單的低速離心就可以與可溶性蛋白分離，有利於分離純化。
4、對機械攪拌和超聲破碎不敏感，易於破壁，並與細胞膜碎片分離。
破菌：
1、機械破碎
2、超聲破碎
3、化學方法破碎
分離：
1、離心：5000-20000g15min離心，可使大多數包涵體沉澱，與可溶性蛋白分離。
2、過濾或萃取方法：
洗滌：
由於脂體及部分破碎的細胞膜及膜蛋白與包涵體粘連在一起，在溶解包涵體之前要先洗滌包涵體，通常用低濃度的變性劑如2M尿素在50mM TrispH7.0-8.5左右,1mMEDTA中洗滌。此外可以用溫和去垢劑TritonX-100洗滌去除膜碎片和膜蛋白。
溶解：
常用的變性劑有尿素（8M）、鹽酸胍（GdnHCl6-8M），通過離子間的相互作用，破壞包涵體蛋白間的氫鍵而增溶蛋白。其中尿素的增溶效果少差，異氰硫酸胍（GdnSCN）最強。
去垢劑：如強的陰離子去垢劑SDS，可以破壞蛋白內的疏水鍵，可以增溶幾乎所有的蛋白。問題是由於SDS無法徹底的去除而不允許在製藥過程中使用。
極端pH：可以破壞蛋白的次級鍵從而增溶蛋白。如有人在pH>9.0溶解牛生長激素和牛凝乳蛋白酶包涵體。有些蛋白可以溶解在60mMHCl中。這些方法隻適合於少部分蛋白的增溶。
變性劑的使用濃度和作用時間：一般在偏堿性性的環境中如pH8.0-9.0，尿素在堿性環境中不穩定，一般不要超過pH1.0。有些蛋白隻能用鹽酸胍如IL-4。增溶時一般室溫過夜，但鹽酸胍在37度1小時便可以使多數蛋白完全變性溶解。
還原劑：
由於蛋白間二硫鍵的存在，在增溶時一般使用還原劑。還原劑的使用濃度一般是50-100mM2-BME或DTT，也有文獻使用5mM濃度。在較粗放的條件下，可以使用5ml/l的濃度。還原劑的使用濃度與蛋白二硫鍵的數目無關，而有些沒有二硫鍵的蛋白加不加還原劑無影響，如牛生長激素包涵體的增溶。對於目標蛋白沒有二硫鍵某些包涵體的增溶，有時還原劑的使用也是必要的，可能由於含二硫鍵的雜蛋白影響了包涵體的溶解。
複性：
通過緩慢去除變性劑使目標蛋白從變性的完全伸展狀態恢複到正常的折疊結構，同時去除還原劑使二硫鍵正常形成。一般在尿素濃度4M左右時複性過程開始，到2M左右時結束。對於鹽酸胍而言，可以從4M開始，到1.5M 時複性過程已經結束。
複性中常采用的方法有：
稀釋複性：直接加入水或緩衝液，放置過夜，缺點是體積增加較大，變性劑稀釋速度太快，不易控製。
透析複性：好處是不增加體積，通過逐漸降低外透液濃度來控製變性劑去除速度，有人稱易形成沉澱，且不適合大規模操作，無法應用到生產規模。
超濾複性：在生產中較多的使用，規模較大，易於對透析速度進行控製，缺點是不適合樣品量較少的情況，且有些蛋白可能在超濾過程中不可逆的變性。
柱上複性：是最近研究較多並成功的在生產中應用的一種複性方法，如華北製藥的G-CSF複性據說是通過柱上複性進行的。常用於複性的層析方法有SEC、HIC等。
還原劑的去除：
還原劑一般和變性劑的去除一起慢慢的氧化去除，使二硫鍵慢慢形成。但是由於二硫鍵的形成並不是蛋白質正確折疊所必須的，可以考慮在變性劑完全去除之後，在去除還原劑使已經按照正確的結構相互接近的巰基間形成正確的二硫鍵。
常用的氧化方法有：
空氣氧化法：在堿性條件下通空氣，或者加入二價銅離子，能夠取得更好的效果，缺點是不易控製氧化還原電勢。
氧化還原電對（redox）：常采用GSSG/GSH，通過調整兩者的比例來控製較精確的氧化還原電勢，也可以在添加了還原劑如BME、DTT的增溶液中直接加入GSSG,如：5mMGSSG/2mM DTT=GSH/GSSG(1.33/1)。
複性的效率：
複性是一個非常複雜的過程，除與蛋白質複性的過程控製相關外，還很大程度上與蛋白質本身的性質有關，有些蛋白非常容易複性，如牛胰RNA酶有12對二硫鍵，在較寬鬆的條件下複性效率可以達到95%以上，而有一些蛋白至今沒有發現能夠對其進行複性的方法如IL-11，很多蛋白的複性效率隻有百分之零點幾。一般說來，蛋白質的複性效率在20%左右。影響複性效率的因素有蛋白質的複性濃度，變性劑的起始濃度和去除速度、溫度、pH、氧化還原電勢、離子強度、共溶劑和其他添加劑的存在與否等。
複性過程的添加劑：
1、共溶劑：如PEG6000-20000，據說可以可逆的修飾折疊中間體的疏水集團，此外由於阻止了蛋白質分子間的相互接觸的機會，也可能對複性效率的提高起作用。一般的使用濃度在0.1%左右，具體條件可根據實驗條件確定。
2、二硫鍵異構酶（PDI）和脯氨酸異構酶（PPI）：PDI可以使錯配的二硫鍵打開並重新組合，從而有利於恢複到正常的結構，此外在複性過程中蛋白質的脯氨酸兩種構象間的轉變需要較高能量，常常是複性過程中的限速步驟，而PPI的作用是促進兩種構象間的轉變，從而促進複性的進行。
3、分子伴侶，即熱休克蛋白（HSP），是一種沒有蛋白質特異性的促進折疊的蛋白因子，研究發現很多蛋白在缺乏分子伴侶時無法自己正確的折疊。有人構建了與伴侶分子共同表達的菌株，據說效果不錯。不過在生產中還沒有看到2和3的應用的例子。
4、0.4-0.6ML-Arg：成功的應用於很多蛋白如t-PA的複性中，可以抑製二聚體的形成。
5、甘油等：增加黏度，減少分子碰撞機會，一般使用濃度在%5-30%。
6、一定的鹽濃度，可能是為了降低某些帶電集團間的斥力，有利於蛋白質的折疊。
7、輔助因子：添加蛋白質活性狀態必須的輔助因子如輔酶輔基等或蛋白配體等很多時候對蛋白質正確的折疊是有利的。
8、色譜法：通過將目標蛋白結合到層析柱上，減少蛋白分子間的相互影響，該方法得到越來越多的應用，常用的色譜有SEC、HIC、IEC、IMAC等。
當然，雖然有很多所謂的理性的複性方案設計，目前的複性工作更多的是一個經驗的過程，沒有一種通用的方法可以套用。
複性時的蛋白濃度：
一般使用濃度為0.1-1mg/ml，太高的濃度容易形成聚體沉澱，太低的濃度不經濟，而且很多蛋白在低濃度時不穩定，很容易變性。
複性效果的檢測：
根據具體的蛋白性質和需要，可以從生化、免疫、物理性質等方麵對蛋白質的複性效率進行檢測。
1、凝膠電泳：一般可以用非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳可以檢測變性和天然狀態的蛋白質，或用非還原的聚丙烯酰胺電泳檢測有二硫鍵的蛋白複性後二硫鍵的配對情況。
2、光譜學方法：可以用紫外差光譜、熒光光譜、圓二色性光譜（CD）等，利用兩種狀態下的光譜學特征進行複性情況的檢測，但一般隻用於複性研究中的過程檢測。
3、色譜方法：如IEX、RP-HPLC、CE等，由於兩種狀態的蛋白色譜行為不同。
4、生物學活性及比活測定：一般用細胞方法或生化方法進行測定，較好的反映了複性蛋白的活性，值得注意的是，不同的測活方法測得的結果不同，而且常常不能完全反映體內活性。
5、黏度和濁度測定：複性後的蛋白溶解度增加，變性狀態時由於疏水殘基暴露，一般水溶性很差，大多形成可見的沉澱析出。
6、免疫學方法：如ELISA、WESTERN等，特別是對結構決定簇的抗體檢驗，比較真實的反映了蛋白質的折疊狀態。
幾個複性的實例：
1、MHCII JBC 269（47）：1994
增溶：16-40mg Protein,8MGdnHCl,16-32mM DTT,1mM EDTA,50mM Tris pH8.037度1hr.
複性：8-16fold dilution to1-5mg/ml Protein.
2、增溶：10mM DTT,0.1%
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