四、包涵體的複性
1、包涵體如何複性
包涵體的複性主要有兩種方式：
1，稀釋溶液，但是操作的液體量大，蛋白稀釋
2，透析，超濾或電滲透析去除變性劑
其中透析很適合實驗室應用，但是時間長。另外，如果蛋白質右兩個以上的2硫鍵，很可能錯誤形成配對，應用還原劑。還有，複性的具體方法還要根據前期試驗及篩選來確定！
另外，你用多大體積的透析緩衝液？可能不夠，要更換幾次
你家了多少蛋白呀 ？蛋白量過大也會使複性困難。
你用的透析代是否是新的，處理過沒有？新代有化學雜質！
最後，有些複性過程就是還有沉澱（透析方法的缺點）看看溶液中蛋白含量，說不定已經夠用了~~
包涵體的複性還要注意以下幾點：
1.首先要獲得較高純度的包涵體。
2.包涵體溶解要徹底，一般應使溶解液體量較大，不要怕蛋白被稀釋，要有助溶措施。
3.透析前後均要離心
4.透析不能太快.
5.純化的最佳條件要摸索。
小技巧：
1）包含體要徹底洗滌幹淨，洗滌液中加入適量Triton-X100.
2) 包含體溶解後裝入透析袋在複性液中複性
3）複性液的組成很有講究，本人使用 Oxidised Glutathione/ Reduced Glutathione 還加入一定的L-Arginine-Hydrochloride 12-24h
4) 複性完畢在低濃度的緩衝液中連續緩慢透析12-24h
5) 複性率的測定 據變性蛋白和非變性蛋白的光學性質不同測定（望有經驗的戰友能更詳細地講解）
6）TritionX100、SDS這一類去垢劑最後不易去除，在製藥行業中一般不允許采用。好像SDS最後殘留量不能大於0.5%吧，忘了。
我用Triton洗滌有些包涵體效果不是很好。包涵體洗滌是純化極為重要的一步，改變培養條件，再洗滌包涵體，有時可以在上柱前已經隻剩下3-4條雜帶，這樣後續的純化就很方便了。因為色譜柱的純化條件比較難optimize。
這段文字可以參考：
用Novagen公司《pET System Manual》提供的方法，分別進行細菌滲透休克，超聲波裂解，研究融合蛋白在細胞周質，細胞質和包涵體中的分布。
滲透休克 用1.2.3方法誘導細菌（10ml體積），測菌液OD600，10000 r/min離心0.5 min去上清，加入滲透休克溶液1（V1= OD 600×V2/5，V1為滲透休克溶液1，V2為培養新鮮菌液），冰浴10 min，10000 r/min離心0.5 min，去上清。加V1體積滲透休克溶液2重懸，搖動冰浴10 min，10000 r/min離心0.5 min，保存上清、細菌沉澱。作如下處理：上清用三氯乙酸(TCA Trichloroacetic acid) 沉澱，加1/10體積100% TCA (w/v)，渦漩15 sec.，冰浴10 min，13000 r/min離心5 min，100 ul丙酮洗滌沉澱，幹燥1 h，加V1/2體積1× PBS（pH 10）溶解，-20℃保存，取10 ul加入等體積2×SB，進行12% SDS-PAGE電泳分析，UNIUER SAL HooD-S.N. 75s 成像係統照相。
超聲波裂解細菌 滲透休克細菌沉澱加1/10培養體積20 mM Tris-HCl（pH 7.5，0℃）重懸，冰浴，超聲波裂解，20%工作選擇，脈衝粉碎1 min，然後13000 r/min離心5 min，-20℃保存上清、細菌沉澱。上清進行TCA沉澱，處理同上。沉澱用Protein Extraction Reagent（Ni-NTAHi Bind Purification Kit BugBuster. 提供 ）按 Novagen公司《pE
提供方法反複處理，洗滌包涵體。包涵體按培養菌100×OD600/3 ul體積加1% SDS溶解，加等體積2×SB，進行12% SDS-PAGE電泳分析，進行蛋白條帶灰度掃描，計算融合蛋白Trx-PrPC27-30占細菌總蛋白的相對含量。
1.2.7重組融合蛋白的純化
PrP-pET-32a（+）轉化表達菌E.coli BL21（DE3），TB培養基中，25℃，AMP 200 ug/ml，搖床（250 r／min）培養至OD600約為1.5，更換等體積新鮮TB培養基，加入IPTG至終濃度1 mM，AMP 200 ug/ml，25℃，4 h，4000 g離心收集菌體。按 Ni-NTA HiBind Purification Kit使用說明溶解包涵體，純化融合蛋白。
或使用筆者改進方法，將Ni-NTA HiBind Purification Kit使用說明中Buffer D改成Wash-Buffer，Buffer-E改成Elute-Buffer，最後用Buffer-E重生Ni-NTA HiBind Rasin，Binding- Buffer平衡以後加50%酒精保存，以免長菌。
洗脫所得蛋白用TCA沉澱，處理同上，得融合蛋白Trx-PrPC27-30，凍幹保存。然後12% SDS-PAGE凝膠電泳分析。
3、包涵體複性2
精氨酸可助溶，但精氨酸是代謝產物高濃度對人可能不好。
另外甘氨酸、纈氨酸、天冬氨酸、穀氨酸、精氨酸有助溶作用。你可以試一試。
對於疏水蛋白的可溶表達，可以降低誘導溫度（可以試試4度誘導過夜）和IPTG的量，降低蛋白的表達速度，從而減少包涵體形成的速度，增加正確折疊蛋白的量。或者換成GST融合表達載體，GST可以增加後麵融合蛋白的可溶表達。我的蛋白包涵體在經變性純化後透析複性過程中，在透析液中加入了1%的甘氨酸和5%的甘油，有一定的助溶效果。我想對於你的情況，由於含有二硫鍵，還要加入一定比例的穀胱甘肽，才能形成正確的二硫鍵。複性是一個很難捉摸的過程，不同蛋白的複性條件也各不相同。
5、包涵體複性問題
包含體複性三大原則：
1。低濃度
2。平緩梯度
3。低溫
有蛋白析出最大的可能型是：蛋白濃度太高，建議你稀釋以後再作透析。
此外，透析的鹽濃度（比如ura）要平緩降低：8m-6m-4m-2m-pbs-H2O。
6、包涵體複性形成聚集物
關鍵是蛋白在複性過程中凝聚了以後，調節PH可以使其溶解，但是這樣複性好的蛋白有沒有活性還是問題，雖然樣品溶解了，但活性不高或沒有也不行呀！
7、複性中蛋白析出！
出現蛋白析出，肯定是條件變化太劇烈了。複性應該采取複性液濃度和PH值逐漸變化的方法，例如根據你包含體的溶液成分，每隔1個PH或濃度值配置一種溶液，逐步透析到正常。此外透析時必須濃度極低，條件溫和，使蛋白質能夠正確折疊。但是複性的比率應該很低。
若加變性劑尿素可加到2M，鹽酸胍可加到1-1.5M；
另外可將甘油濃度增加，範圍可在≤30%，且在複性樣品中也可加適量甘油；一些拙見。
8、包涵體複性液配方
對於包涵體複性，一般在尿素濃度4M左右時複性過程開始，到2M 左右時結束。對於鹽酸胍而言，可以從4M開始，到1.5M 時複性過程已經結束。TRIS係統和PBS係統都沒有明確的規定，這些需要你在實驗過程中不斷試驗，確定合適的緩衝係統；不過複性過程主要是注意以下幾個問題：
1）最適pH值範圍為8.0-9.0之間；
2) 溫度適宜選擇4℃；
3）複性過程蛋白濃度不宜過大，一般為0.1-0.2mg/mL；
4) 複性時間一般為24-36小時；
5) 低分子化合物 如L-Arg有助於增加複性中間產物的溶解度；脲、鹽酸胍、烷基脲、以及碳酸酰胺類等，在非變性濃度下是很有效的促進劑，都可阻止蛋白聚集；Tris對蛋白質複性有促進作用；EDTA可以防止蛋白降解；
6) 氧化還原體係，如GSH/GSSG、DTT/GSSG、DTE/GSSG等.。
還有就是你的蛋白質的特性
9、什麽叫複性成功
複性效果的檢測：
根據具體的蛋白性質和需要，可以從生化、免疫、物理性質等方麵對蛋白質的複性效率進行檢測。
1，凝膠電泳：一般可以用非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳可以檢測變性和天然狀態的蛋白質，或用非還原的聚丙烯酰胺電泳檢測有二硫鍵的蛋白複性後二硫鍵的配對情況。
2，光譜學方法：可以用紫外差光譜、熒光光譜、圓二色性光譜（CD）等，利用兩種狀態下的光譜學特征進行複性情況的檢測，但一般隻用於複性研究中的過程檢測。
3，色譜方法：如IEX、RP-HPLC、CE等，由於兩種狀態的蛋白色譜行為不同，
4，生物學活性及比活測定：一般用細胞方法或生化方法進行測定，較好的反映了複性蛋白的活性，值得注意的是，不同的測活方法測得的結果不同，而且常常不能完全反映體內活性。
5，黏度和濁度測定：複性後的蛋白溶解度增加，變性狀態時由於疏水殘基暴露，一般水溶性很差，大多形成可見的沉澱析出。
6，免疫學方法：如ELISA、WESTERN等，特別是對結構決定簇的抗體檢驗，比較真實的反映了蛋白質的折疊狀態。
在正常的生理條件下，組成蛋白質的多肽鏈都能以獨特的方式進行折疊，形成自己特有的空間結構，以執行某一些生命活動。當外界環境改變時，可能造成基因突變和蛋白質序列改變，錯誤剪接和運輸，錯誤折疊和異常聚積，形成對機體有害的反應，引起構象病的發生和無生物活性、不可溶的包涵體形成。目前對包涵體形成和複性過程中發生聚集的機製尚不清楚，許多已建立的高效複性方法是在反複實驗和優化的基礎上建立的，且沒有普遍性，但從這許許多多的個例中發現了一些規律：如聚集的發生是由鏈間的疏水相互作用介導、聚集具有相對特異性、折疊中間體可能具有不同的作用等等，並利用這些知識建立了一些重組蛋白質高效複興性的方法。相信隨著結構生物學、生物信息學、蛋白質工程學及相關新技術和新設備的發展和完善，在不久的將來，預測和設計最佳複性方案將成為可能。
另外，還向這位戰友薦一文章，有關包涵體蛋白複性的文章！
10、怎樣鑒定融合蛋白複性是否成功
問：最近在做GST融合蛋白的純化，由於目的蛋白主要存在於包涵體中，所以在變性條件下將包涵體溶解，經複性，透析後用GSH sepharose 4B純化，結果得到了比較純的融合蛋白，這是否說明GST的活性已得到恢複（因為能與GSH結合），請問這種情況下，是否能代表我的目的蛋白的活性也得到了恢複？由於我的目的蛋白隻是一個蛋白的某一段，不具有酶活性，也不是什麽受體之類的，所以不知如何鑒定它的活性。
如果我得到的是變性的融合蛋白，那麽用於製備多抗或者單抗會有影響嗎？
如果我的融合蛋白是可溶性的，那麽用GSH sepharose 4B純化得到的融合蛋白可以直接用於製備多抗嗎？溶液中的GSH，Tis等成分對免疫動物有影響嗎？是否需要透析除取這些成分才能去免疫動物呢？
答：1）。不可以。GST 具體多大忘記了，但做為TAG 使用的蛋白一般是很小的一段AA，可以用相對應的抗體做PULL DOWN，親和純化等。但蛋白的活性是需要構象存在的，一小段TAG 空間結構幾乎沒有，就算是沒有恢複活性的蛋白也可以與這小段AA 對應的抗體結合。
2）。變性蛋白隻是天然蛋白伸直的了產物，用來免疫動物具有更強的抗原性。隻是天然蛋白中被包在內部的抗原決定簇也會暴露出來，如果用該變性抗原製備的抗體來檢測變性抗原是可以的，如果用來檢測天然蛋白，可能會有假陽性。做單抗也可以，同樣道理，篩選出的單抗可能對抗的抗原決定簇處於天然抗原的內部，是否能用還要看將來該單抗用來幹什麽。
3）。免疫動物要求抗原體種盡量小。在這種小體積的情況下，緩衝液裏的小分子成分隻要沒毒影響就不大，可以不用考慮。
4） GST為26kd,你得到的蛋白活性應通過 目的蛋白功能分析才能驗證是否複性。GST融合蛋白可以免疫動物，但抗體純化須用GSH-sepharose 4B 和蛋白A或G進一步純化，去掉抗GST抗體，如果你的目的蛋白很大，可以凝血酶切割除去 ＧＳＴ，再免疫動物.GSH,Tris 是小 分子，沒影響。
5） 既然目的蛋白沒有活性，何來得活性鑒定，複性是否成功，就主要是看是否恢複到原來特有的三級結構，這就要看你目的蛋白的特異性，和天然的目的蛋白片斷進行比較，看其複性是否徹底，這必須有個對照，才能知道複性是否完全。不知道你得到目的蛋白有什麽用處，如果是用來做抗原，就沒有必要進行活性鑒定了。
變性的融合蛋白做抗原是沒有影響的，gst的分子量是26kda，當然，如果將融合伴侶除去，抗體的特異性會要更好一些，如果不除，影響也不會很大。最好進行透析，除去溶液中的雜物質，但是Tris沒有什麽關係，其就如同PBS一樣，本身是緩衝體係，不會對免疫造成太大影響。
6） 做抗原的話，變性了沒關係的；純化後可以直接免疫動物，我們這就有人做，不過他是用的His融合表達；掛著GST挺好的，不切也行，蛋白大些豈不是抗原性更強些
另外，你看沒看過菌液上清裏的蛋白量？那裏可能有許多的有活性的蛋白呀！
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