二、包涵體的洗滌
1、包涵體的洗滌問題
通常的洗滌方法一般是洗不幹淨的，我以前是這麽做的，先把包涵體用6M鹽酸胍溶解充分，過濾除去未溶解的物質，注意留樣跑電泳，然後用水稀釋到4M,離心把沉澱和上清分別跑電泳，如此類推可以一直稀釋到合適的濃度，你可以找到一個合適去除雜質的辦法，其實這就是梯度沉澱的方法，我覺得比通常的直接洗脫效果好。
包涵體一般難溶解，所以你要注意未溶解的部分，你可以跑電泳對比，因為有時候難溶解的就是你的目標蛋白，所以每次處理都要把上清和沉澱跑電泳對比，免得把目標蛋白弄丟了。
此外剛處理完的包涵體好溶解。冷凍後難溶解，溶解也需要長點時間，也需要大量的溶劑。如果說是不少不溶解的不是你要的，那就不用管了。
2、如何得到比較純的包涵體
對於包涵體的純化，包涵體的前處理是很重要的。
包涵體中主要含有重組蛋白,但也含有一些細菌成分,如一些外膜蛋白、質粒ＤＮＡ和其它雜質。洗滌常用1%以下的中性去垢劑，如Tween、Triton、Lubel和 NP40等加EDTA和還原劑2-巰基蘇糖醇（DTT）、β-巰基乙醇等反複多次進行，因去垢劑洗滌能力隨溶液離子強度升高而加強，在洗滌包涵體時可加50 mM NaCL。這樣提取的包涵體純度至少可達50%以上，而且可保持元結構。也可用低濃度的鹽酸胍或尿素/中性去垢劑/EDTA/還原劑等洗去包涵體表麵吸附的大部分不溶性雜蛋白。洗滌液pH以與工程菌生理條件相近為宜，使用的還原劑為0.1-5mM。EDTA為0.1-0.3 mM。去垢劑如Triton X-100、脫氧膽酸鹽和低濃度的變性劑如尿素充分洗滌去除雜質,這一步很重要,因為大腸杆菌外膜蛋白Omp T(37 KDa)在4-8mol/L尿素中具有蛋白水解酶活性,在包涵體的溶解和複性過程中可導致重組蛋白質的降解。
對於尿素和鹽酸胍的選擇：
尿素和鹽酸胍屬中強度變性劑，易經透析和超濾除去。它們對包涵體氫鍵有較強的可逆性變性作用，所需濃度尿素8-10M，鹽酸胍6-8M。尿素溶解包涵體較鹽酸胍慢而弱，溶解度為70-90%，尿素在作用時間較長或溫度較高時會裂解形成氰酸鹽，對重組蛋白質的氨基進行共價修飾，但用尿素溶解具有不電離，呈中性，成本低，蛋白質複性後除去不會造成大量蛋白質沉澱以及溶解的包涵體可選用多種色譜法純化等優點，故目前已被廣泛采用。
鹽酸胍溶解能力達95%以上，且溶解作用快而不造成重組蛋白質的共價修飾。但它也有成本高、在酸性條件下易產生沉澱、複性後除去可能造成大量蛋白質沉澱和對蛋白質離子交換色譜有幹擾等缺點。
包涵體最後的純化，一般是離子交換，疏水，或者是親和層析，親和層析尤其是金屬螯合層析用得比較廣泛，而純化的效果也不錯，通常是一步就能達到純度為95%以上的包涵體。
8M高濃度尿素溶解後離心獲得的包涵體溶解液，放在4度冰箱過夜後出現沉澱，這種現象我也在實驗中遇到過;開始感覺很奇怪，後來發現是我們的冰箱的溫控出了問題實驗際溫度要比設定溫度低至少4度（嗬嗬，不好意思！）。不過我接著往下進行SDS-PAGE、層析等發現沒有什麽不良影響。所以，你不用擔心也許你的蛋白也隻是和你開了個玩笑呢！
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