關於包涵體的純化是一個令人頭疼的問題，包涵體的複性已經成為生物製藥的瓶頸，關於包涵體的處理一般包括這麽幾步：菌體的破碎、包涵體的洗滌、溶解、複性以及純化，內容比較龐雜。
一、菌體的裂解
1、怎樣裂解細菌？
細胞的破碎方法
1.高速組織搗碎：將材料配成稀糊狀液，放置於筒內約1/3體積，蓋緊筒蓋，將調速器先撥至最慢處，開動開關後，逐步加速至所需速度。此法適用於動物內髒組織、植物肉質種子等。
2.玻璃勻漿器勻漿：先將剪碎的組織置於管中，再套入研杆來回研磨，上下移動，即可將細胞研碎，此法細胞破碎程度比高速組織搗碎機為高，適用於量少和動物髒器組織。
3.超聲波處理法：用一定功率的超聲波處理細胞懸液，使細胞急劇震蕩破裂，此法多適用於微生物材料，用大腸杆菌製備各種酶，常選用50-100毫克菌體/毫升濃度，在1KG至10KG頻率下處理10-15分鍾，此法的缺點是在處理過程會產生大量的熱，應采取相應降溫措施，時間以及超聲間歇時間、超聲時間可以自己調整，超聲完全了菌液應該變清亮，如果不放心可以在顯微鏡下觀察。對超聲波及熱敏感的蛋白和核酸應慎用。
4.反複凍融法：將細胞在-20度以下冰凍，室溫融解，反複幾次，由於細胞內冰粒形成和剩餘細胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細胞結構破碎。
5.化學處理法：有些動物細胞，例如腫瘤細胞可采用十二烷基磺酸鈉（SDS）、去氧膽酸鈉等細胞膜破壞，細菌細胞壁較厚，可采用溶菌酶處理效果更好，我用的濃度一般為1mg/ml。
無論用哪一種方法破碎組織細胞，都會使細胞內蛋白質或核酸水解酶釋放到溶液中，使大分子生物降解，導致天然物質量的減少，加入二異丙基氟磷酸（DFP）可以抑製或減慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑製那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，而且應該在破碎的同時多加幾次；另外，還可通過選擇pH、溫度或離子強度等，使這些條件都要適合於目的物質的提取。
這是標準配方:
裂解液：50mM Tris-HCl(pH8.5~9.0), 2mM EDTA, 100mM NaCl, 0.5% Triton X-100, 1mg/ml溶菌酶。(溶菌酶在這個pH範圍內比較好發揮作用)
但我個人的經驗是:如果你裂解細菌是為了提取蛋白的話,而且蛋白的分子量又小於20kd的話,盡量減少溶菌酶的用量,會引入溶菌酶這種雜蛋白.一般配60ml裂解液用藥匙匙柄盛一點就夠.判斷裂解好壞的標準是,溶液很粘.
protocol是10ml-50ml緩衝液(菌體洗滌液,裂解液等)/1g濕菌體.
如果隻做一個鑒定,我覺得100-200ml菌就夠了.
但凡超聲,我都用60ml裂解液,因為我們的超聲儀(現代分子生物學實驗技術錄象裏的那種)很適合用100ml小燒杯,裝60ml裂解液,這樣能讓超聲頭離液麵不高不低,不會冒泡泡,也不會灑出來.菌多我就延長超聲時間.
沉澱,也就是包涵體沉澱了,如果要上柱純化,一定要先用4M尿素洗滌一下再用8M尿素溶解.如果不上柱,隻是跑跑電泳,可以直接用8M尿素溶解以後,離心取上清,加入適量體積的loading buffer.loading buffer對於包涵體的溶解能力是較弱的.
"取200微升菌液，離心後直接加上樣buffer，100度3分鍾後上樣，然後SDSPAGE. 這個方法到底能不能溶解細菌中的包涵體? "
而樓主的問題,雖然loading buffer對於包涵體的溶解能力是較弱的,但是我覺得你的做法隻是在鑒定有無表達,用loading buffer是沒有問題的.
2、表達重組蛋白時，細菌裂解方法都有哪些？
在表達重組蛋白時，誘導以後跑SDS-PAGE發現表達都很好，但是在裂解細胞時遇到問題。總是不能徹底裂解細胞。
首先我采用超聲裂解，可是不管我如何超聲總有部分細菌沒有裂解。
我的超聲條件如下：寧波新芝超聲細胞破碎儀，功率400W，超5秒，間隔5秒，重複99次。然後顯微鏡觀察，不徹底時再重複99次。菌體來自200 ml培養液，用20 ml PBS重懸。
然後我又嚐試加溶菌酶，首先加至終濃度100 ug/ml，4C半小時菌液不變粘，加大濃度至1 mg/ml，半小時後仍無明顯變化。因為我用的PBS是pH7.4，我懷疑是pH不合適，換用pH8.0 TE buffer，1 mg/ml溶菌酶，4C半小時仍無明顯變粘。因為這次使用的溶菌酶是前一天配好的，擔心溶菌酶失效，重新稱取凍幹粉末，直接加入菌液，仍然沒有明顯變化。
真是鬱悶。到底出了什麽事？請高手解答，並介紹優化的方案。
同時希望能介紹一下如何選擇細胞破碎方法，以及如何確定最佳條件。
溶菌酶在pH7.4時是否沒有活性了？可否配成濃縮液保存溶菌酶，如果可以，應如何保存？
加入溶菌酶以後，如果細胞壁已破壞，菌液應該變粘吧，因為核酸被釋放出來。
而超聲破碎細胞，我覺得菌液是不會變粘的，因為超聲可以把大分子核酸打碎成小片段。
我判斷細胞破碎不完全是因為，在將破碎後樣品離心分離上清和沉澱跑SDS-PAGE觀察，發現在細胞碎片組分中除了經常出現的一兩條帶以外，還有菌體總蛋白樣品中的很多帶出現。據此可以判斷細胞隻是部分破碎。
不知我的分析是否正確，請版主和各位高手指教。
如果溶菌酶效果還可以，我覺得先用溶菌酶初步裂解細胞，然後再用超聲進一步破碎並斷裂大分子核酸以降低粘度的細胞破碎策略可能比較好。因為超聲有可能使蛋白變性，但單用溶菌酶不能確定是否完全破碎，還要再加核酸酶降低粘度。這種兩步法策略應該還可以減少破碎條件優化的時間。
我用的溶菌酶放置時間比較長了，有可能失活了。我剛從生工又定了一支，不過得後天到貨，但願它有用。
如何觀察溶菌酶是否已裂解細胞，通過觀察粘度變化是否可以？
隻反複凍融是否可以有效裂解大腸杆菌細胞？
溶菌酶隻有在pH值大於8.0的條件下才能發揮溶菌作用，請務必保持PBS的pH＞8.0，同時溶菌酶的量一定要足！
在加入溶菌酶後，最好放於磁力攪拌器上攪拌30分鍾，再進行超聲破菌，我的超聲條件是：功率400W，工作2秒，間隔2秒，重複199次。菌體來自500 ml培養物，用30 ml PBS重懸，超聲效率還是可以的。
哪兒的溶菌酶好用？
我用生工的溶菌酶，稱取幹粉20mg。200ml菌液用18 ml NaCl重懸，加入2 ml 25mM Tris-HCl(pH8.0)，將溶菌酶幹粉加入體係，混勻，測pH降低到5－6，加20 ul 2M Tris堿，體係pH升到～8。4C放置1小時，菌液上層變澄清，搖動發現體係沒有變粘。測pH仍在8左右。再37C保溫1小時，還沒有變化，我簡直不知如何才好了。
另一瓶200ml培養物，溶菌酶處理1小時後超聲。條件：300W，超5秒停5秒，重複99次。菌液有變化，但很不明顯。繼續超聲400次，從外觀來看沒有太大區別。我簡直要說tmd了。見鬼了。
我的操作有什麽地方不妥當，請各位指正。
溶菌酶的廠商要求是否很重要？
我的誘導物來自1：20過夜培養物接種，37C生長3小時後30C誘導2小時（0.8mM IPTG）。
是否菌液太濃，Pharmacia的說明書200 ml培養物用10 ml重懸，我用20 ml，仍然不夠稀？有人告訴我菌液應該稀一些，200 ml用30－40 ml重懸。但實際操作也不夠理想。
SDS-PAGE總是觀察到細胞破碎效果不夠徹底。超聲那麽多次，蛋白都要被超碎變性了。
3、酵母的破碎
酵母是一類單細胞真菌的總稱，其成員分別屬於不同的真菌綱，細胞壁成分是否會有較大差別，這些都是做破碎酵母細胞前要考慮的。我歸納了一下，做破碎酵母的幾種方法：
1 機械的方法：一般的PROTOCOL都是用glass beads：如 sigma G-8772，加玻璃珠後超聲，蛋白活性保持較好。
2 化學裂解的方法：10g酵母 加1ml的乙酸乙酯，充分攪拌至液體狀（希望高手點評）
3 尿素裂解液（尿素8mol/L, NaCl 0.5mol/L,Tris 20mmol/L, EDTA 20mmol/L, 2%SDS, PH值8.0）高壓勻漿。（這個好象也該在方法2中）
4 液氮凍融並研磨酵母破壁，我認為這種可能在小試中比較合適。
5 溫和的酶法，可能不會會破壞酵母原生質體
酶法裂解主要用兩種酶：1。蝸牛酶，可以直接從蝸牛的胃液中獲得；2。lyticase，可以從sigma定購。這兩種酶解法都可以和上麵的幾種方法結合使用，尤其是glass beads方法，效果很好。
我用過化學裂解的方法，10g酵母 加1ml的乙酸乙酯，充分攪拌至液體狀。此法的裂解效果不錯的，不妨試一下。
一篇文章是加尿素裂解液（尿素8mol/L, NaCl 0.5mol/L,Tris 20mmol/L, EDTA 20mmol/L, 2%SDS, PH值8.0），據說效果可以
酵母破碎效果好的我所做過的方法中還是玻璃珠，就象microbe 和rongjunli所說的那樣，效率很高的，而且對目的蛋白活性不會有什麽影響。一般應該用這個方法。
4、超聲破碎的條件選擇
超聲破碎的條件不能一概而論，要看你的實驗要求，有的是細菌破碎，有的是對組織細胞進行破碎，要掌握好功率和每次超聲時間，功率大時，每次超聲時間可縮短，不能讓溫度升高，必要時在冰浴條件下進行超聲破碎。至於每次超聲時是否起泡沫到不是關鍵的問題，這與你超聲的量明顯有關。
5、如何鑒定細菌超聲破碎的程度
最簡單的方法：塗片--革蘭氏結晶紫溶液染色0.5分鍾---顯微鏡觀察
切記：隻用結晶紫染色，別忘了染色後再用水稍衝洗一下
6、細菌裂解的DNaseI
不同純度的酶換算標準不同，所以你最好查查是哪個公司的酶？仔細看說明書，可能會有換算說明。
另外看一下參考文獻所用的酶是哪個公司的，到該公司的主頁也可能有收獲。
我用過華美和TAKARA的DNA酶，華美的是用mg/ml。華美也有RNase free的DNA酶，定量用活性單位。TAKARA的兩種酶都是用活性單位定量的。
我在超聲裂解細菌時加入一些DNA酶，一般用超聲液加不同量的酶做一個預實驗，選取符合你需要的酶量。
其實根據目的和方法的不同，所需要的酶量也是可調節的，比如酶切溫度（16度或37度）。
7、超聲裂解細菌是否完全？
最簡單的方法：塗片--革蘭氏結晶紫溶液染色0.5分鍾---顯微鏡觀察
切記：隻用結晶紫染色
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