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玫瑰組織培養研究進展(二)



錄入時間:2011-8-25 16:57:04 來源:中國生命科學實驗

 2 玫瑰組織培養的方法

    2.1 外植體選取 從生長在田間或盆栽的優良品種植株上,選取生長健壯、無病蟲害的當年生枝條的莖尖和幼莖。取材最好在晴天正午,並且取用植株上部的幼莖。陰雨天或靠近地麵的幼莖,表麵汙染較為嚴重,難於消毒。玫瑰除用莖尖和幼莖做外植體外,也可以用葉片、葉柄、根、莖、原生質體、胚、花藥、子房、花萼和花托做外植體[7]。

    2.2 消毒滅菌及無菌苗的建立 取玫瑰外植體,用5%~10%的次氯酸鈉浸泡10~30min或用01%~02%的HgCl浸泡5~15min。用無菌水清洗7~10次後接種。也可先用75%的酒精浸泡20~30s再采用上述方法消毒。消毒滅菌完畢後,將幼莖切割成05~10cm長的至少帶有一個節的切段,接種於培養基中[6]。

    2.3 愈傷組織的誘導 Hill(1967)最早報道從雜交茶香月季(hybridtea rose)的莖上誘導了愈傷組織,該實驗證明在培養基中添加2,4-D或添加NAA和激動素KT均能很快誘導出愈傷組織。隨後不同實驗以不同品種為試驗材料,從葉、葉柄、根、莖、原生質體、合子胚、花藥、子房、花瓣、花萼、和花托成功地誘導了愈傷組織。[7]

    2.3.1 愈傷組織的成功誘導與品種的基因型有關?搖Lloyd等(1988)曾研究Rose prsica與xanthina,hybrida,Clarissa,Rcabrosa的愈傷發生能力,發現隻有Rose persica與xanthina在MS基本培養基上,添加低濃度的BAP和NAA時,節間能產生愈傷,愈傷組織脆弱,呈淡黃綠色。Kunitake等(1993)研究了Rose rugosa Thunb,Rose multiflora,Rose allbacv,SemiplenaRose hybridacv,DuplesRose harisonii,Roses pinosissi的未成熟種子的愈傷發生能力,發現隻有Rose rugosa Thurb能產生愈傷組織,品種Rontl和Soraya比品種Baccara和Mercedes更易產生愈傷(Kintzios等,1999)。[7]

    2.3.2 外植體類型?搖Aren等(1993)詳細地調查了Rose hybrida cvMeirutral不同外植體的愈傷誘導率,發現不同外植體愈傷產生的能力不同,葉為90%,根為70%,節間為55%,花藥為19%。

    2.3.3 激素 激素也是影響愈傷生成的重要因素,Rout等(1991)以Landora為材料,在添加BA和NAA,2,4-D的MS的培養基上,外植體在接種的7~12d後,在近軸麵的葉柄和中脈處產生愈傷,愈傷組織誘導頻率高達92%。在接種後15~20d,外植體莖切端處產生愈傷,誘導率為76%。生長素種類和濃度對愈傷產生能力的影響同樣很大。早期實驗多采用NAA結合BAP或BA等,近年來多采用2,4—D,並證明2,4—D是誘導愈傷的必要因素(Kintzios等,1999;Rout等,1996;van der Salm等,1996;Vises—suwan等,1997)。進一步研究發現2,4-D對愈傷的誘導效果依賴於月季的基因型,如2,4—D濃度從113umol/L增加到181umol/L降低了Rose hybrida栽培種“Care-freeBeauty”的愈傷誘導頻率,但該濃度則對另一個品種“Grand Gala”無影響。對於“Red Sunblaze”而言,當濃度從113umol/L增加到452umol/L,則表現出愈傷的誘導率提高了,隨後當2,4—D再增加,則顯著地降低愈傷的誘導頻率。愈傷組織在誘導愈傷組織的培養基上能得到很好繼代培養(subculture、Li等,2002)。Van der Salm等(1996)證明2,4—D對誘導Rose persica與xanthina和Moneyway產生愈傷是非常必要的,進一步添加低濃度的BA有正效應,但如BA濃度過高,則產生抑製作用。與以上實驗結果不同,Kintzios等(1999)則發現2,4—D對愈傷誘導有負影響作用,可能因為采用的外植體是成熟的葉片。

    2.3.4 合子胚的發育時期對愈傷的形成能力也有影響?搖如處於心形胚的合子胚,其愈傷誘導率隻有2%,子葉胚時的合子胚愈傷誘導率達到85%。[7]

    2.4 不定芽的誘導 月季的常規繁殖方式主要靠扡插、嫁接和壓條等,繁殖係數低,遠遠滿足不了生產的需要。80年代初,采取組織培養方法快速繁殖月季苗,用側芽、頂芽、並誘導生根。第一報道月季不定芽形成見Elliott(1970),他在聚花月季(Rose multiflora)上成功地誘導了不定芽的形成,並誘導幼苗生根。Zieslin和Halevy(1976)報道細胞分裂素有利於提高不定芽的數量,但也誘導花器官敗育或退化的頻率。不定芽的誘導與供試材料的基因型有關,同時還與外植體的取材部位有關,來源於枝條中部的側芽的繁殖速率最快(Bressan等,1982)。培養基中添加蔗糖有增加叢芽數量的作用(Langford和wainwright,1987);加入低濃度的GA能進一步改善芽繁殖,95%的外植體能產生7個以上的不定芽(Rout等1990)。能提高芽繁殖數量的物質還有月桂酸甲酯(Voyiatzi等,1995)、乙烯(Kevers等,1992)等。誘導不定芽的培養基為MS培養基添加低濃度的激素BAP03~05mg/L,NAA0004~03mg/L或IAA或GA00~20mg/L。[7]Martin等(1981)調查了2125個玫瑰側芽做外植體獲得的無菌苗三年間在大田生長的情況,沒有發現變異植株,這說明側芽方式繁殖的玫瑰植株性狀很穩定。

    2.5 增殖培養 玫瑰的增殖培養,一靠無菌苗切段繁殖,二靠誘導不定芽,形成從生苗;三靠愈傷組織形成體細胞胚或原球胚。將已長大的月季嫩莖切成帶1~2個節的莖段,投入新鮮的增殖培養基上,5~6周進行一次繼代增殖,增殖係數平均達4~6。在外植到培養10~15d內第一葉的葉原基伸長,第二葉片葉原基可見;15~20d側芽伸長;25~30d長度達6~10mm,繼代增殖會按幾何級數增長起來。[5]增殖培養基可用不定芽誘導培養基,如MS+BA03~05+NAA0004~03mg/L。

    2.6 壯苗與生根 壯苗培養的培養基為:MS+BA03~05+NAA001~01或MS+BA03~05+IBA03。 [4]也可以壯苗為主,增殖為輔,使增殖與壯苗合二為一。玫瑰組培苗增殖與壯苗需光照10~12h,光照強度2000lx,溫度24~26℃。[4]

    玫瑰在組培過程中,其生根能力因品種特性、所用植物材料及培養基成分而有較大差異,許多研究結果表明,玫瑰莖段微繁殖容易生根,使用植物激素IAA,IBA或NAA含量01~05mg/L,蔗糖含量2%~25%的MS培養基有利於玫瑰莖段生根。另外,光照、溫度等對玫瑰微繁殖生根也有直接影響,Bressan等(1982)研究指出,光照時間每天12h以上,光照強度適宜則有利於生根。一般情況下,玫瑰莖段組織培養8~10d內則可生根。[6]加入適量的活性炭有利於玫瑰生根。

    2.7 煉苗與大田移栽 煉苗和大田移植是玫瑰微 繁殖獲得成功的最後階段。[6]組培幼苗由人為培養環境轉移到天然生長環境中,環境條件發生巨大變化,濕度大幅度降低,溫度不恒定,光照強烈,微生物多,故需煉苗過渡。一般玫瑰微繁殖煉苗需經過室內三天的取蓋煉苗,然後將苗從瓶中取出,洗去根部培養基,定植在珍珠岩、泥炭、蛭石或沙土中,用3~5%的多菌靈噴洗。煉苗時要注意基質中的水分含量,水分太少,不能滿足苗生長發育;水分太多,導致爛苗。煉苗中、後期要注意通氣,給予足夠的光照,其幼苗成活率可達80%以上。[6]

 

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