1.4.3 電子顯微鏡計數
本世紀三十年代初電子顯微鏡的發明,使我們能夠觀察到病毒的分子及其細微結構。1940年Kausche和Melcher首次在電子顯微鏡下觀察到煙草花葉病毒的顆粒。電鏡技術的建立對病毒學的發展起了巨大的推動作用。
在實際生產過程中,根據病毒的種類與特點的不同,往往需要把幾種方法結合起來,就可望建立一套快速、靈敏、準確、高效的水體植物病毒的檢測方法。
1.4.4.分子生物學法
分子生物學檢測法能夠檢測病毒的侵染能力。此方法靈敏度最高,能檢測到pg級甚至fg級[1fg(飛克)=1×10-15g]的病毒,特異性強,檢測速度快,操作簡便,可用於大量樣品的檢測(侯義龍,2000)。目前,常用的分子生物學方法有核酸分子雜交技術、dsRNA電泳技術、多聚酶鏈式反應技術等。侯義龍.果樹主要病毒RT-PCR檢測體係的建立、優化及病毒特異DNA片段克隆測序研究.[博士學位論文].沈陽:沈陽農業大學,2000.6
核酸分子雜交技術 具有一定同源性的2條核酸單鏈在一定的條件下(適宜的溫度及離子強度等)可按堿基互補原則退火形成雙鏈。此雜交過程是高度特異性的。雜交的雙方是使用的探針和要檢測—的核酸。待測核酸可以是克隆的基因片段,也可以是未克隆化的基因組DNA和細胞總RNA。根據使用的方法,被檢測核酸可以是提純的(膜上印跡雜交或液相雜交),也可以在細胞內雜交(細胞原位雜交) (盧聖棟,1999)。
雙鏈RNA(dsDNA)電泳技術 ssRNA病毒在植物體內增殖,通過核酸互補而形成一種健康植物沒有的堿基配對dsRNA。DsRNA經提純、電泳、染色後,在凝膠上所顯示的譜帶可以反映每種病毒組群的特異性,並且有些單個病毒的dsRNA在電泳圖譜上也顯示一定的特征。因此,利用病毒dsRNA的電泳圖譜可以檢測出病毒的類型和種類(董穎蘋,2001;李鵬翔,2000)。此法已用於一些病毒組(如黃化病毒組、馬鈴薯Y病毒組、番石竹潛病毒組、煙草壞死病毒組、黃瓜花葉病毒組、絨毛煙斑駁病毒組)的分類研究。
多聚酶鏈式反應(polymerasechainreaction,PCR)技術 是一種在體外快速擴增特定基因或DNA序列的方法,是近10年來發展和普及最迅速的分子生物學新技術之一(吳乃虎,2000;)。由於它具有強大的擴增能力,並且可與其它分子生物學方法(如核酸雜交)和免疫學方法(如ELISA)相結合應用,使其敏感性和特異性都大大增強;因而廣泛地應用於生物醫學領域的各個學科(梁國棟,2001)。靈敏度最高, 儀器價格昂貴,試驗技術要求高。
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