1.4.2血清學方法
血清學方法原理是利用抗原抗體的體外特異性結合檢測植物病毒。主要包括沉澱反應、凝聚反應、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、免疫電鏡(IEM)、放射免疫測定(RIA)、PCR(聚合酶蓮式反應)法等。
沉澱反應 將可溶性抗原與相應的抗體混合,當兩者的比例合適,並有鹽類存在時,即有沉澱物出現,叫做沉澱反應。由於沉澱物主要是由抗體球蛋白所組成,為了保證有足夠的抗體,因此試驗時通常要稀釋抗原,不稀釋抗體。
凝聚反應 在微生物細胞懸液中,加入含有特異性抗體的血清,有一定濃度的電解質,微生物細胞凝聚成團,叫做凝聚反應。分為直接凝聚反應與間接凝聚反應。由於病毒是可溶性抗原,必須把病毒的抗體先吸附於一種與免疫無關的顆粒表麵,然後與相應的抗原結合反應。用於吸附抗體的顆粒有皂土、乳膠、炭末、紅細胞等。
酶聯免疫吸附試驗(Enzyme linked Immunosorbent assay,簡稱ELISA)將酶標記物同抗原抗體複合物的免疫反應與酶的催化放大作用相結合,既保持了酶催化反應的敏感性,又保持了抗原抗體反應的特異性,因而極大的提高了靈敏度;同時它又是一種非均相分析過程,即在反應中的每一步之後都有洗滌過程,從而排除了未反應物質的幹擾。自1976年 Voller和Clark等首次將ELISA應用於植物病毒檢測,已形成多種測試方法。常用的方法有有細胞直接法、細胞間接法、競爭法、酶抗酶法、雙夾心法(Double sandwich method)、雙抗體夾心法(Double antibody sandwich method)測定方式(侯義龍,2000)。這種方法的靈敏度高(可測出1-10納克/毫升的濃度),特異性強,操作簡便,已廣泛應用於病毒測定和診斷(盛樹力,1978;馬德芳等,1981)。
免疫電鏡(IEM)是用電鏡檢測抗體特異性結合於抗原的技術。Anderson等(1961)和Lafferty與Oertelis(1961)發展了這一方法。其靈敏度高於ELISA。
放射免疫測定(RIA)在抗原抗體反應體係中,當同位素標記抗原(Ag*)與有限量的抗體相互作用時,形成有標記抗原的複合物(Ag*Ab)。如下式所示:
Ag*+Ab Ag*Ab
Ag AgAb
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