（一）細菌的分離培養
1．培養基製作的原則和一般步驟
（1）培養基製作的原則 培養基是人工方法將多種物質按照各類微生物生長 的需要而合成的一種混合營養料，一般用以分離和培養菌類。常用的培養基有基礎培養基、增菌培養基、選擇培養基、鑒別培養基等。在製作培養基時應掌握如下原則和要求：
①培養基必須含有細菌生長所需要的營養物質。
②必須徹底滅菌,不得含有任何活細菌。
③培養基的材料和盛培養基的容器上,沒有抑製細菌生長的物質。
④所製備培養基應該是透明的，以便觀察細菌生長性狀和其它代謝活動所產生的變化。
⑤培養基的酸堿度應該符合細菌的生長要求，多數細菌生長適宜範圍是弱堿（pH7.1~7.6）。
（2）培養基製備的一般過程 不同的培養基其製備方法不同，一般要經如下步驟：
①根據不同的菌類和用途，選擇適宜的培養基。
②精確稱量各種成分。
③將各種成分按規定加熱溶解，調整pH到適宜的範圍內。再加熱煮沸10~15分鍾（注意補加液體的損耗）
④過濾（用濾袋或紗布棉花），分裝、滅菌（不同的培養基的滅菌溫度和時間不同，通常為
⑤培養基中的某些成分，象血清、腹水、糖類、尿素、氨基酸、酶等，在高溫下易分解，變性，故應用濾菌器過濾，再按規定的溫度和量加入培養基中。
⑥無菌檢驗，取作好的培養基數管，置
2．細菌的分離培養
在細菌學診斷中，細菌的分離培養是不可缺少的一環，分離培養的目的是在病料中由多種細菌裏挑選出可疑菌。在分離培養之前，首先應該注意下列事項：
（1）選擇適合於所含分離細菌生長的培養基。
（2）培養溫度一般在
（3）考慮所分離的細菌是需氧性或厭氧性，進一步決定培養條件。
（4）初步分離時發現有多種細菌，應進一步選擇可疑菌落進行純培養
（二） 細菌的接種
1．平板劃線法 此法為常用的細菌分離培養法。平板劃線培養的方法甚多，可按各人的習慣選擇應用，其目的都是將被檢材料作適當的稀釋，以求獲得獨立單在的菌落，防止發育成菌苔，以致不易鑒別其菌落性狀。劃線培養時須注意以下幾點：
（1）左手持皿，用左手拇指，食指及中指將皿蓋揭開成20度左右的角度（角度愈小愈好，以免空氣中的細菌進入皿中將培養基汙染）。
（2）右手持接種環，將材料少許塗布於培養基邊緣，然後將接種環上多餘的材料在火焰中燒毀，待接種環冷卻後，再與塗材料之處輕輕接觸，開始劃線。
（3）劃線時先將接種環稍稍彎曲，這易和平皿內瓊脂平行，不致劃破培養基。
（4）劃線中不宜過多地重複舊線，以免形成菌苔。
（5）平皿蓋向下，在培養皿上標注樣品名稱、編號、接種日期後，置溫箱中培養。
2．斜麵接種法
3．液體培養基接種法
（三）細菌培養性狀觀察
1．細菌在液體培養基中生長性狀觀察
（1）渾濁度 觀察是否透明，輕度渾濁，中度渾濁或極度渾濁，還有均勻渾濁，顆粒狀渾濁，絮狀渾濁。
（2）沉澱 試管底有無沉澱，沉澱物呈顆粒狀，粘稠狀或絮狀。輕搖時雲霧狀，絮狀或發辮狀開起。
（3）表麵 有無菌膜及附著於管壁的菌環。
（4）色素及氣味
2．細菌在固體培養基上菌落生長性狀觀察
（1）大小 各種細菌菌落大小差異很大，菌落直徑在1毫米以下為露滴狀菌落；1~2毫米為小菌落；2~4毫米為中等大菌落；4~6毫米或更大為大菌落。
（2）形狀 有圓形、規則形、根足形、菌絲狀等。
（3）邊緣 有整齊、鋸齒狀、纖毛狀、卷發狀等。
（4）表麵 有光滑、濕滑、粗糙、顆粒狀、皺絲狀、同心狀、放射狀等。
（5）降起度 有角平、隆起、臍狀、扭扣狀。
（6）顏色 有無色、白色、灰白色、金黃色、檸檬色、綠色、紅色等。
（7）透明度 有透明、半透明、不透明等。
（四）顯微鏡檢查——細菌抹片製備、染色及鏡檢
細菌細胞微小，無色而半透明，原樣直接在普通光學顯微鏡下觀察，隻能大致見到其外貌，製成抹片和染色之後，則能較清楚地顯示其形態和特殊構造，也可以根據不同的染色反應，作為鑒別細菌的一種依據。
常應用各種染料對細菌進行染色，由於毛細管、滲透、吸附和吸收等物理作用，以及離子交換，酸堿等化學作用，染料就能使細菌著色，且因細菌細胞的結構和化學成分不同，而含有不同的染色反應。
1．細菌抹片的製備
進行細菌染色之前，須先作好細菌抹片，其方法如下：
（1）玻片準備 載玻片應清晰透明、潔淨而無油漬，滴上水後，能均勻展開，附著性好。如有油漬，可按下列方法處理：
①滴上95%酒精2~3滴，用潔淨紗布揩擦，然後在酒精燈火焰上輕輕拖過幾次。
②若上法仍未能去除油漬，可再滴上1~2滴冰醋酸，用紗布擦淨，再在酒精燈火焰上輕輕通過。
（2）抹片 所用材料情況不同，抹片方法亦有差異。
液體材料（如液體培養物、血液、滲出液、乳汁等）可直接用滅菌接種環取一環材料，於玻片的中央均勻地塗布成適當大小的薄層。
不是液體材料（如菌落、膿、糞便等）則應先用滅菌接種環取少量生理鹽水或蒸餾水，置於玻片中央，然後再用滅菌接種環取少量材料，在液滴中混合，均勻塗布成適當大小的薄層。
組織髒器材料，先用鑷子夾持局部，然後以滅菌或潔淨剪刀取一小塊，夾出後將其新鮮切麵在玻片上壓積或塗抹成一薄片。
如有多個樣品同時需要製成抹片，隻要染色方法相同，亦可以在同一張玻片上有秩序地排好，作多點塗抹，或者先用蠟筆在玻片上劃分成若幹小方格，每方格塗抹一種樣品，需要保留標本片，應貼標簽，注明菌名、材料、染色方法和製片日期等。
（3）幹燥 上述塗片，應讓其自然幹燥。
（4）固定 有兩類固定方法。
① 火焰固定 將幹燥好的抹片，使塗抹麵向上，以其背麵在酒精燈火焰上來回通過數次，略作加熱（但不能太熱，以不燙手背為度）進行固定。
② 化學固定 血液、組織髒器等抹片要作姬姆薩（Giemsa）染色，不用火焰固定，而應用甲醇固定，可將已幹燥的抹片浸入甲醇中2~3 分鍾，取出晾幹；或者在抹片上滴加數滴甲醇使其作用2~3分鍾後，自然揮發幹燥。抹片如作瑞特氏染色（Wright’s stain），則必先須作特別固定，染料中含有甲醇，可以達到固定的目的。
將抹片固定的目的有如下幾種：
①除去抹片的水分，塗抹材料能很好地貼附玻片，以免水洗時易被衝掉
②使抹片易於著色或更好地著色，因為死的蛋白質比活的蛋白質著色力較強。
③可能殺死抹片中的微生物。
必須注意：在抹片固定過程中，實際上並不能保證殺死全部細菌，也不能完全避免在染色水洗時不將部分抹片衝脫。因此，在製備烈性病原菌，特別是帶芽孢的病原菌的染色抹片時，應嚴格慎重處理染色用過殘液和抹片本身，以免引起病原的散播。
固定好的抹片，即可進行各種方法的染色。
2．幾種常用染色方法
常用的細菌染色方法，主要有兩種類型：
（1）簡單染色法 隻應用一種染料進行染色的方法，如美藍染色法。
（2）複染色法 應用兩種或兩種以上的染料或再加媒染劑進行染色的方法。染色時，有些是將染料分別先後使用，有些則同時混合使用。染色後不同的細菌和物體，或者細菌構造的不同部分可以呈現不同的顏色，有鑒別細菌的作用，又可稱為鑒別染色，如革蘭氏染色法、抗酸性染色法、瑞特氏染色法和姬姆薩染色法。
①美藍染色法 在已幹燥、固定好的抹片上，滴加適量的（足夠覆蓋塗抹點即可）美藍染色液，經1~3分鍾，水洗，幹燥（可用吸水紙吸幹，或自然幹燥，但不能烤幹），鏡檢。
②革蘭氏染色法
A．在已幹燥、固定好的抹片上，滴加草酸銨結晶紫染色液，經1~2 分鍾，水洗。
B．加革蘭氏碘溶液於抹片上媒染，作用1~2 分鍾，水洗。
C．加95%酒精於抹片上脫色，約0.5~1 分鍾，水洗。
D．加稀釋石炭酸複紅（或沙黃水溶液）複染10~30秒，水洗。
E．吸幹或自然幹燥，鏡檢。革蘭氏陽性菌呈藍紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。
③ 抗酸染色法
A．萋一尼（Ziehl-Neelsen）氏抗酸染色法 首先在已幹燥、固定好的抹片上，滴加較多量的石炭酸複紅染色液，在玻片下以酒精燈火焰微微加熱至發生蒸氣為度（不要煮沸），維持微微發生蒸氣，經3~5分鍾，水洗。然後用3%鹽酸酒精脫色，至標本紅色脫出為止，充分水洗。再用堿性美蘭染色液複染約1分鍾，水洗。最後吸幹，鏡檢。抗酸性細菌呈紅色，非抗酸細菌呈藍色。
B．又法之一：將固定後的抹片滴加金（Kinyoun）氏石炭酸複紅液，曆3 分鍾。此液配法為：
堿性複紅
石炭酸（化學純） 9毫升 蒸餾水 100毫升
溶堿性複紅於酒精，再緩緩加水並搖振，再加入石炭酸混合。
連續水洗1.5分鍾後滴加加鮑脫（Gabbott）氏複染液曆1分鍾。此液配法為：
美藍
濃硫酸 20毫升 蒸餾水 50毫升
先將美藍溶於乙醇，再加蒸餾水，再加硫酸。
連續水洗1 分鍾，吸幹，鏡檢。抗酸菌呈紅色，其他菌呈藍色。
C.又法之二：滴加石炭酸複紅液於抹片（已幹燥固定過的）上染1 分鍾；水洗；再用1%美藍酒精溶液複染20秒；水洗，幹燥，鏡檢。抗酸菌紅色。
鏡檢前對光檢查染色片，標本片務必全呈藍色。如標本片呈現紅色或棕色，表示複染不足，應再作複染5~10 秒，再觀察。如仍未全呈藍色時，仍可反複複染，至符合要求為止。
④ 瑞氏染色法
方法一：抹片自然幹燥後，滴加瑞特氏染色液於其上，為了避免很快變幹，染色液可稍多加些，或者看情況補充滴加，經1~3分鍾，再加約與染液等量的中性蒸餾水或緩衝液，輕輕晃動玻片，使與染液混勻，經5分鍾左右，直接用水衝洗（不可先將染液傾去），吸幹或烘幹，鏡檢。細菌染成藍色，組織、細胞等物呈其他顏色。
方法二：抹片自然幹燥後，按塗抹點大小，蓋上一塊略大的清潔濾紙片，在其上輕輕滴加染色液，至略浸過濾紙，並看情況補滴，維持不使變幹；染色3~5分鍾鍾，直接以水衝洗，吸幹或烘幹，鏡檢。此法的染色液經濾紙濾過，可大大避免沉渣粘附抹片上而影響鏡檢觀察。
⑤ 姬姆薩氏染色法
A.於5毫升新煮過的中性蒸餾水中滴加5~10滴姬姆薩染色液原液，即稀釋成 常用的姬姆薩染色液。
B.抹片經甲醇固定並幹燥後，在其上滴加足量染色液或將抹片浸入盛有染色液的染色缸中，染色30分鍾，或者染色數小時至24小時，取出水洗，吸幹或烘幹，鏡檢。細菌呈藍青色，組織、細胞等呈其他顏色，視野常呈紅色。
3.細菌基本形態及構造的觀察
（1）細菌的形態
①球菌：
雙球菌：注意其成雙的排列，兩個菌體接觸麵的形狀以及菌體的形態。
鏈球菌：注意其鏈狀排列，鏈的長短，個體的形態。
四聯球菌：注意其四個聯結成方形排列的形態。
八疊球菌：注意其八個堆疊一起，呈立體方形的形態。
葡萄球菌：注意其無一定次序，無一定數目，不規則地堆在一起的形態。
②杆菌：
單杆菌：注意其單個散在的狀態，菌體外形、大小、菌端的形狀。
雙杆菌：注意其成雙的排列以及菌體外形、大小、菌端的形狀。
鏈杆菌：注意其成鏈狀排列，鏈的長短，菌體外形、大小、菌端的形狀。
③螺旋狀菌：
弧菌：注意其彎曲成弧形以及菌體大小，菌端的形狀。
螺菌：注意其具有兩個彎曲以上的螺旋狀及菌體的長度、大小，菌端的形狀。
（2）細菌的一些構造
①莢膜：注意莢膜的位置、形狀、大小、染色及相互間的聯結。
②鞭毛：注意鞭毛的形狀、長度、大小、數目及其在菌體上的排列（單毛、叢毛、周毛）。
③ 芽孢：注意芽孢的形狀，與菌體相比的大小以及在菌體中的位置（中央、偏端、末端）。
④異染顆粒：注意其與菌體不同的染色反應、形狀、大小、多少、位置等。
（五） 動物試驗
為了作細菌或其它微生物的分離鑒定，致病力測定等，常用實驗動物進行接種，常用的實驗動物接種方法有下列數種。
1． 皮下接種
（1）家兔皮下接種 由助手把兔伏臥或仰臥保定，於其背側或腹側皮下結締組織疏鬆部分剪毛消毒，術者右手持注射器，以左手拇指、指食和中指捏起皮膚使成一個三角形皺褶，於其底部進針，感到針頭可隨意撥動即表示插入皮下。當壓入注射物時感到流利暢通也表示在皮下。拔出注射針頭時用消毒棉球壓住針孔並稍加按摩。
（2）豚鼠皮下接種 保定和術式同家兔。
（3）小白鼠皮下注射 作小白鼠皮下注射接種無須助手幫助保定。術者在做好接種準備後，以右手捏取鼠尾，此時鼠頭會向前掙紮而可以緊牽其尾，然後用左手的拇指和食指捏住其兩耳及其頭頸部皮膚使其翻轉，背部皮膚固定於左手中指、無名指及拇指基部之間，以小指壓住其尾根，小白鼠即仰臥保定於左手上。右手操作局部消毒，把持注射器，以針頭稍微挑起皮膚插入皮下，注入時見有水泡微微鼓起即表示注入皮下。拔出針頭後，同家兔皮下注射時一樣處理。
2．皮內接種 作家兔、豚鼠及小白鼠的皮內接種時，均需助手保定動物，其保定方法與皮下接種相同。接種時術者以左手拇指及食指夾起皮膚，右手持注射器，針頭要很細，針頭插入拇指與食指之間的皮膚內，針頭插入不宜過深，同時針頭插入角度要小，即與夾起的皮膚平行，注射時感到有阻力且注射完畢後皮膚上有小硬皰即為注入皮內的表現。皮內接種要慢，否則容易使皮膚脹裂或自針孔流出注射物而散播傳染。
3．腹腔內接種 在家兔、豚鼠及小白鼠的腹腔接種，宜采取仰臥保定。接種時其後軀應稍抬高使其內髒傾向前腔，接種部位在腹後側麵，針頭先插入皮下，後進入腹腔，注射後皮膚應無皰隆起。其餘術式同於皮下接種法。
4．靜脈注射
（1）家兔的靜脈注射 將家兔納入保定器內或由助手保定兔體露出其頭。選一側耳邊緣靜脈，助手以拇指及食指緊壓耳根部，使靜脈努張，術者剪去靜脈管上皮膚的毛，消毒局部，若需對同一動物作多次接種時，應自接近耳尖初處開始刺入接種，以後逐次接近耳根。接種時術者左手執兔耳，右手持針（針頭不宜太細），以與靜脈平行方向刺入靜脈，同時助手放鬆其緊壓手指，以便血液流通。注射時無阻力且有血向前流即表示注入靜脈。緩緩注射，注射完針頭拔出後，用消毒棉球緊壓針孔片刻，以免流血或注射物溢出。
（2）豚鼠靜脈內接種 豚鼠靜脈內接種比較困難，因為豚鼠沒有裸露明顯的靜脈可尋，若必須作注射時，使豚鼠伏臥保定，腹麵向下，將其後肢剃毛，用70%酒精消毒皮膚，施以全身麻醉，用銳利刀片向後肢內上側向外下方切一長約一厘米的切口，使露出皮下靜脈，用最小號針頭（26號），刺入靜脈慢慢注入接種物。接種完畢，皮膚應縫合一兩針。
（3）小白鼠靜脈接種 作小白鼠靜脈內接種時，選尾側靜脈，體重在15~
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