植物病毒病是農業生產上一種重要病害,嚴重影響農作物的產量和質量, 目前還沒有1種治療效果較理想的藥劑,對發病植株做到早期診斷及提前檢測就顯得尤為重要。植物病毒學曆經近百年的發展,植物病毒的檢測方法與手段也在不斷發展與改進。常用的方法有侵染力測定法、血清學方法、電子顯微鏡計數和分子生物學法等。
1.4.1侵染力測定法
侵染力測定法是將病毒樣本接種在植物上,根據侵染力的大小定量。它的靈敏度在所有定量法中是比較高的,而且是其他定量法的基礎。設計一種新的定量法,如果不經過侵染力的驗證,將無法判斷測定的是病毒或者是具有侵染力的病毒。侵染力測定法包括局部枯斑法、澱粉-碘斑法、係統感染率的測定法等。侵染力測定多用粗汁液來接種,為了避免抑製物質的作用和使半葉枯斑數目控製在一定範圍,須用緩衝液稀釋接種物。
局部枯斑法 1929年F.O.Holmes發現TMV在心葉煙(Nicotiana glutinosa)接種葉片上引起局部壞死斑點,在一定的病毒濃度範圍內,所產生的斑點數目與病毒濃度成正比例。這一發現成為病毒侵染性定量測定的基礎(田波,1987)。所有機械傳染的病毒都有可能應用局部斑點法,但實際上隻有少數病毒具有可用於定量測定的局部斑寄主。一個待測樣品所形成的斑點數目除取決於接種物中病毒濃度外,還受試驗植物種類、環境條件和接種物中是否含有病毒抑製物質的影響。
澱粉-碘斑法 當所研究的病毒沒有過敏性枯斑寄主時,采用此法。Holmes(1931)發現TMV接種的煙葉上有時形成明顯的黃化斑塊,但不能用於計數。將這種接種葉用95%乙醇加熱到80℃固定,然後用I2和KI混合液(10克I2,30克KI,1500毫升H2O)染色時,則侵染點處出現澱粉-碘的藍色反應。當下午采摘葉片,褪色過夜,然後用碘液染色,則侵染點較周圍組織著色淺;當采摘葉片前,植株先在黑暗中放幾個小時,再用碘液染色,則侵染點組織著色深。這是由於病毒侵染既降低光合組織中碳水化合物的形成,也降低碳水化合物從光合組織中的運出。澱粉-碘染色的強弱受環境條件的影響較大,不如局部枯斑法可靠,但在標準化條件下仍可用於侵染性的定量測定。
侵染性滴度法 當上述方法都不適用時,可采用侵染性滴度法。即把欲測定樣品用緩衝液稀釋,可用十倍稀釋、成倍稀釋、半倍稀釋或更低稀釋。這種方法的缺點是需用大量實驗植物,但可得到較好的結果。此方法可用於介體傳染的病毒。
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