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細菌的人工培養



錄入時間:2011-8-19 9:36:10 來源:動物微生物學

 

用人工方法,提供細菌在自然環境或動物體內生長繁殖需要的基本條件,達到細菌培養、鑒定及進一步利用的目的。人工培養細菌,除需提供充足的營養物質外,尚需有合適的酸堿度、適宜的溫度及必要的氣體環境。在營養豐富、生長繁殖條件適宜時,細菌生長繁殖最為迅速。

一、細菌的營養需要

細菌種類繁多,營養需要千差萬別,但其基本營養要求不外水分、無機鹽類、含碳化合物和含氮化合物,個別細菌還需要生長因子等特殊物質。

(一)水分

水雖不屬於嚴格的營養物質,但細菌生長繁殖需要大量的水分。水除是細菌的主要組成成分之一外,同時又是一種良好的溶劑,許多物質溶解於水中才能被細菌吸收,細菌的滲透、分泌和排泄以及水解和許多生化反應等作用都以水為媒介。另外,水的比熱大,利於熱的吸收和散發,可有效地調節細胞與所處環境的溫度。

(二)無機鹽類

無機鹽類可提供細菌生長所需的一些元素,根據對其需要量可分為常量元素和微量元素。一般情況下,這些元素在所供給的水、營養物質中含有,不需特殊提供。但有些細菌,如嗜鹽菌對Na+和Cl-有特殊需要

(三)含碳化合物

細菌合成碳水化合物,進一步合成多糖、脂類、蛋白質、核酸等組成成分需要碳素營養,自養菌是以CO2或碳酸鹽為碳源,異養菌則以有機含碳化合物為碳源,也需要少量的CO2,可由分解代謝所產生的CO2滿足其需要。有些異養菌在培養開始時,需先加一些CO2以促進其生長。異養菌最常利用的碳源是糖類,另外還有有機酸、醇類、脂類以及氨基酸等。糖類以單糖(己糖)主要是葡萄糖和果糖,幾乎所有異養菌均可利用;雙糖中的蔗糖、乳糖、麥芽糖等某些細菌可利用;多糖中的澱粉,病原菌往往可能利用,而纖維素、果膠等隻能為某些自然界的細菌所利用。細菌能利用什麽種類的糖類物質或含碳物質並產生什麽樣的產物,這可作為細菌鑒定的依據。

在培養細菌時,因細菌可利用氨基酸中的碳素,往往不需添加任何糖類。

(四)含氮化合物

有機的、無機的含氮化合物均可作為細菌氮源,但細菌種類不同而對氮源要求有所差異。有些細菌(如固氮菌)可利用空氣中的分子狀態的氮,而大多數細菌能利用無機的銨鹽、硝酸鹽以及有機的氨基酸。許多病原菌不能利用無機含氮化合物,需要供給有機含氮化合物才能生長。高分子的蛋白腖和蛋白質,細菌不能直接利用,必須經由細菌分泌的蛋白水解酶降解為肽或氨基酸後才能利用。

由於細菌種類不同,利用無機含氮化合物的能力不同,可作為細菌鑒定的依據。

(五)生長因子

除上述營養物外,有些細菌還需特殊的物質才能生長或促進其生長,這類物質稱為生長因子(growth factor)。生長因子多為維生素或維生素類似物,主要是B族維生素,還有對氨基苯甲酸和穀氨酰胺等,主要作為輔酶或輔基的成分而起作用。此外,還有一些化合物為某些細菌生長所必需,如嗜血杆菌生長需要血液中的X因子和V因子。X因子與氯化高鐵血紅蛋白相同,V因子是輔酶I(NAD)或輔酶II(NADP)。生長因子通常由酵母浸出物、血液、腹水或血清供給。對生長因子需要的不同,也可作為細菌鑒定的依據。

二、細菌生長繁殖的條件

細菌要正常的生長繁殖,必須具備符合其生理特性的一定環境條件。

(一)營養物質

根據細菌的營養需要,要滿足其生長所必需的水分、無機鹽、含碳化合物、含氮化合物以及生長因子等。所提供的營養物質應不含對細菌生長有害、有毒的成分。

(二)溫度

不同細菌對溫度有不同適應範圍,各種細菌又有各自的可生長溫度範圍及最適溫度。根據細菌對溫度的適應範圍,可將細菌分為三類:嗜冷菌(psychrophile),生長範圍-5~30,最適生長10~20;嗜溫菌(mesophile),生長範圍10~45,最適20~40;嗜熱菌(termophile),生長範圍25~95,最適50~60。病原菌已適應動物的體溫,因此均為嗜溫菌。某些嗜冷菌對魚類等變溫動物有致病性。

(三)酸堿度

pH影響微生物的生長,每種細菌均有一個可適應的pH範圍及最適生長pH。雖然大多數細菌在pH 6~8之間可以生長,但多數病原菌的最適pH7.2~7.6,個別偏酸,如鼻疽假單胞菌(Pseudomonas mallei)為pH 6.4~6.6;或偏堿,如腸球菌(Enterococcus)為pH 9.6。在細菌生長過程中,能使培養基變酸或變堿而影響其生長,所以在培養基中往往需要加入一定的緩衝劑。

(四)氧氣 

根據細菌對氧的要求,可將其分為需氧菌、厭氧菌及兼性厭氧菌。需氧菌(aerobe)行需氧呼吸,必須在有一定濃度的遊離氧的條件下才能生長繁殖,其中隻需低分子氧濃度(2%10%)者特稱微需氧菌(microaerophilic bacteria)。厭氧菌(anaerobe)行厭氧呼吸,必須在無遊離氧或其濃度極低的條件下才能存活。其原因是,細菌在代謝過程中產生對菌體有毒性的過氧化氫(H2O2)、超氧陰離子(O2-)和羥自由基(OH•)等,厭氧菌部分或全部缺乏降解這些產物的酶,如過氧化氫酶、過氧化物酶、超氧化物歧化酶等,因O2-或H2O2的毒性作用死亡。兼性厭氧菌(facultative anaerobe)既可行需氧呼吸,又可行厭氧呼吸,通常在有氧條件比無氧環境生長更好。

(五)滲透壓

細菌生長有一定的可生長滲透壓範圍和最適滲透壓,大多數細菌生長最適滲透壓為等滲環境,也有些細菌(如嗜鹽菌)適宜高滲環境。細菌一般較其他生物細胞對滲透壓的改變有較大的適應能力。

三、培養基(culture medium

培養基是人工配製的基質,含有細菌生長繁殖必需的營養物質。培養基製成後,通常都要經滅菌處理。按營養組成的差異,可將培養基分為基礎培養基(basal medium)及營養培養基(nutrient medium)。前者含多數細菌生長繁殖所需的基本營養成分,常用新鮮牛肉浸膏,加入適量的蛋白腖、NaCl、磷酸鹽,調節pH7.2~7.6即成。在基礎培養基中,添加葡萄糖、血液或血清等,即為營養培養基,最常用的是血瓊脂平板。

按狀態的差異,可將培養基分為固體培養基、半固體培養基及液體培養三類。液體培養基(liquid medium)即不加凝固劑的基礎培養基或營養培養基,用於擴增純培養的菌體、確定細菌生長曲線等。在液體培養基中加入1%~2%的瓊脂,即成為遇熱融化、冷卻後凝固的固體培養基(solid medium),用於細菌的分離、純化、生物活性檢測等。如將加入液體培養基的瓊脂減半,用0.5%左右,即成為半固體培養基(semi-solid medium),可作穿刺試驗,觀察細菌的動力及短期保藏菌種等。

按功能的差異,可將培養基分為鑒別培養基、選擇培養基及厭氧培養基。在培養基中加入特定作用底物及產生顯色反應的指示劑,即可憑肉眼根據顏色識別,這就是鑒別培養基(differential medium)。在培養基中加入某種化學物質,對不同細菌分別產生抑製或促進作用,從而可從混雜多種細菌的樣本分離出所需細菌,此即為選擇培養基(selective medium)。最常用的有麥康凱(MacConkey)培養基,內含膽酸鹽,能抑製革蘭氏陽性菌的生長,有利於大腸杆菌及沙門氏菌的生長。在實際使用中,鑒別與選擇兩種功能往往結合在一種培養基之中。厭氧培養基(anaerobic medium)是為培養厭氧菌而設計的,是在培養基中加入還原劑如巰基乙酸鈉等,或用石蠟或凡士林封住培養基表麵,隔絕空氣,有的還需放入無氧氣培養箱維持無氧環境。庖肉培養基(cooked meat medium)是常用的厭氧培養基,其中含不飽和脂肪酸和穀胱甘肽的肉渣起到還原劑的作用。

 

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