細胞的凍存和複蘇
錄入時間:2011-8-11 15:49:29
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一、原理
在不加任何條件下直接凍存細胞時，細胞內和外環境中的水都會形成冰晶，能導致細胞內發生機械損傷、電解質升高、滲透壓改變、脫水、
PH改變、蛋白變性等，能引起細胞死亡。如向培養液加入保護劑，可使冰點降低。在緩慢的凍結條件下，能使細胞內水份在凍結前透出細胞。貯
存在－130℃以下的低溫中能減少冰晶的形成。
細胞複蘇時速度要快，使之迅速通過細胞最易受損的－5～0℃，細胞仍能生長，活力受損不大。
目前常用的保護劑為二甲亞碸（DMSO）和甘油，它們對細胞無毒性，分子量小，溶解度大，易穿透細胞。
二、操作步驟
（一）凍存
1、消化細胞（同實驗二），將細胞懸液收集至離心管中。
2、1000rpm離心10分鍾，棄上清液。
3、沉澱加含保護液的培養，計數，調整至5×106/ml左右。
4、將懸液分至凍存管中，每管1 ml。
5、將凍存管口封嚴。如用安瓿瓶則火焰封口，封口一定要嚴，否則複蘇時易出現爆裂。
6、貼上標簽，寫明細胞種類，凍存日期。凍存管外拴一金屬重物和一細繩。
7、按下列順序降溫：室溫→4℃（20分鍾〕→冰箱冷凍室（30分鍾）→低溫冰箱（－30℃ 1小時）→氣態氮（30分鍾）→液氮。
注意：操作時應小心，以免液氮凍傷。液氮定期檢查，隨時補充，絕對不能揮發幹淨，一般30立升的液氮能用1～1.5月。
（二）複蘇
1、準備一個茶缸或1000ml的燒壞，內裝2/3杯37℃的溫水。
2、從液氮中取出凍存管、迅速置於溫水中並不斷攪動。使凍存管中的凍存物在1分鍾之內融化。
3、打開凍存管，將細胞懸液吸到離心管中。
4、1000rpm離心10分鍾，棄去上清液。
5、沉澱加10ml培養液，吹打均勻，再離心10分鍾，棄上清液。
6、加適當培養基後將細胞轉移至培養瓶中，37℃培養，第二天觀察生長情況。
三、試劑和器材
器材：液氮罐、凍存管（塑料螺口專用凍存管或安瓿瓶）、離心管、吸管、離心機等
試劑：0.25％胰酶、培養基、含保護劑的培養基（即凍存液）
附：凍存液配製：
培養基加入甘油或DSMO，使其終濃度達5—20%。保護劑的種類和用量視不同細胞而不同。配好後4℃下保存。
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