細菌的轉導
錄入時間:2011-8-11 15:28:44
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一、基本知識與原理
轉導是以噬菌體為媒介將一個細胞的遺傳物質轉移給另一個細胞的過程。隨著分子遺傳學的發展，轉身已成為基因精細結構分析的常用方法之一。
根據噬菌體轉導供體菌基因的差異，轉導可分為普遍性轉導和局限性轉導。這裏以局限性轉導為例說明轉導的基本原理。局限性轉導實驗中常用的是大噬菌體，它能整合在大腸杆菌染色體DNA上的半乳糖基因（gAl）和生物素基因（bib）之間，因此，它能轉導半乳糖基因（一）又能轉導生物素基因（bio）。
本實驗選用大腸杆菌 E。oh K．2（A）為供體菌（即大噬菌體的DNA已整合在大腸杆菌的DNA上，我們稱該大腸杆菌為溶源性大腸杆菌，’gAT””為帶有半乳糖基因）。由於在此供體菌中噬菌體與半乳糖基因（匆”）緊密連鎖，因此，當此供體菌受紫外線照射後會產生裂解反應，噬菌體被誘發釋放，以一定的比例形成帶有半乳糖基因的轉導噬菌體。當這種轉導噬菌體與受體菌 ECo］i K；。 s gAl－（此細菌不能利用半乳糖，‘’表示此細菌半乳糖基因發生突變）混合接觸時，帶有一基因的轉導噬菌體能以一定的頻率整合到受體首上，從而使不能利用半乳糖的 gAl一受體菌轉變成了能利用半乳糖的 gAT”細菌。整個過程可用圖12－’表示：l
二、實驗目的和要求
以局限性轉導為例來說明轉導的基本原理，進一步驗證是遺傳物質，並初步掌握轉導實驗的基本方法。
三、實驗器材
（1）實驗材料：供體菌 受體菌
（2）實驗試劑：肉湯液體培養基、肉湯固體培養基、ZE 肉湯液體培養基、半固體瓊脂培養基、半乳糖Emb培養基、滅菌生理鹽水（或磷酸緩衝液）
D（3）實驗設備：培養皿（9厘米）、三角燒瓶（50毫升）、試管、離心管，離心機，移液管，塗棒，水浴鍋，離心機，紫外照射箱、溫箱
四、實驗方法與步驟
1 噬菌體的誘導和裂解液的製備
（1）供體菌的活化與培養，取—環供體菌，接種於盛有sml肉湯液體培養基的三角瓶中37度培養16h後，吸取0.5毫升菌液，接種於盛有肉4.5毫升肉湯液體培養基的三角瓶中，繼續培養4～6小時。
（2）製備懸浮液將三角瓶中的菌液倒人離心管，以 3 500 rlmlN， 離心 10 miN。離心後，除去上清液，加 4ml磷酸緩衝液，混勻沉澱，再以 3 smr/miN，離心 10。i。，這樣反複洗三次，製備成懸浮液。
（3）誘導裂解：取懸浮液 3。；i於培養皿中，經 UV處理（15 W，距離 40Cm），誘導 10－20。
（4）避光培養； UV處理後，加人 3 ml ZE肉湯液體培養基，為了防止光複活，立即置於37 T避光培養 2－3 h．
（5）製備裂解液：吸取培養物於離心管中，以 3 500 r/rUiN，離心 10 miN，吸取上清液，再加人02 ml氯仿（4－5滴），激烈振蕩30 s，靜置5 mlN，再次以 3 55 r/miN，離心 10 mlN，小心把上清波用無菌吸管轉移到另一試管，這就是噬菌體（A） gAl”的裂解液。
2轉導方法
（l）點滴法：①取倒好Emb培養基的培養皿2隻，在皿底用記號筆按圖中的樣子 畫好。
②取一滿環受體菌，塗出一條菌帶，共塗二條， 37 T培養 15 ho ＠取出培養皿
在2個圓圈和四個方格處，各加一環噬菌體裂解液，2個圓圈作為對照，四個方格作為
轉導處理，見圖 12—2，培養 2 D，觀察結果。
3塗布法：①取倒好的Emb培養皿三隻，先做好標記，其中一加 oJ ml噬菌體裂解液，用於對照Z一隻加 oJ ml受體菌，也用於對照，一隻加噬菌體裂解液和受體菌液各 005 ml、②用玻璃塗棒將各皿上的菌液（或噬菌體裂解液）塗開，相同的2隻培養皿用同一根玻璃塗棒，37 T培養 2 D，觀察結果。
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