病毒學實驗技術（5）

細胞的製備

應用細胞種類很多，茲以原代豬腎細胞為例。

（一）無菌取胚胎或仔豬腎。

（二）去腎被膜，切開腎為兩半，剪去腎盂及髓質部。

（三）以含青黴素各200單位／ml的磷酸鹽緩衝鹽水洗去血球，用剪刀剪成約小米粒大的小塊，移於滅菌三角瓶中。

（四）再用含抗菌素的磷酸鹽緩衝液洗3～4次至洗液徹底清亮為止。

（五）加入3～4倍以上體積的35℃胰酶液，在電磁攪拌器上攪拌消化（如無電磁攪拌器可置40℃水浴鍋中，內加無菌玻璃珠搖動），攪拌（或搖振）時以發生旋渦而不起泡沫為度，至液體明顯混濁時（約10分鍾左右），再用吸管或注射器吹打數次，待組織塊沉澱後，將上層被消化後的細胞吸出，再加入消化液，將餘下組織塊再同樣消化於40℃10～20分鍾，再次吹打，分散細胞，將兩次消化液匯合一起，經四層紗布過濾，收集濾液，離心（1500轉／分，10分鍾），棄上清液，加入含抗菌素的（見前述）漢克斯氏液懸浮，再離心，棄上清，加入營養液（見下述）懸浮，再離心。

亦可將組織塊在4℃下消化16～24小時（所謂冷消化法），攪拌，吹打，收集細胞液，離心，同上述。

（六）末次離心後，棄上液，加入少許營養液懸浮，用計算白血球的方法計算每毫升中細胞數，計數發現細胞太多時可取少許濃細胞液加營養液適當稀釋後再計。

 （七）根據計數結果，以營養液稀釋到每毫升含腎細胞100萬個。有經驗的工作人員，可以不計數，稀釋細胞到適當的混濁度即可。

營養液：取10 ml小牛血清，80ml漢克斯氏液和10 ml  5％乳蛋白水解物配成營養液，加雙抗使每ml營養液中含青、鏈黴素各200單位。青、鏈黴素事先可配成各20000單位/ml的溶液。

（八）分裝於小玻瓶（小型實驗室可用空的鏈黴素瓶，洗淨，滅菌）中，鏈黴素瓶裝1ml，並以蠟筆作瓶的上下記號。

平放靜置37℃孵育兩天後，每日檢查，至長成單層為度，快則2～3天，慢則6～7天。如液體混濁說明有細菌生長，並往往變酸或有黴菌生長時，應廢棄。

（九）換液加病毒

長成單層後，吸棄營養液，加入9ml維持液。維持液中血清含量比營養液少一半（抗菌素含量同上）。接種含病毒的材料0.1ml，放回溫箱再培養。

（十）觀察及收獲病毒  每日檢查一次，凡有黴菌及細菌生長者棄之。病毒在其中生長，可引起細胞變性，原生質出現顆粒狀，核濃縮或裂解，有的還明顯的引起細胞溶解，出現空斑。發現有細胞變化或空斑時，即可將液體收集保存，同時做無菌檢驗。所收集的液體即繁殖的病毒液。有的病毒在細胞培養上生長，但細胞不出現病變，此時應以其它方法檢查，如回歸動物、END法、熒光抗體檢查等等。

瓶上細胞檢查可作為一個標本保存，即吸去內溶液以後，經甲醇固定，姬姆薩液染色，水洗，幹燥後保存。

傳代細胞比初代細胞易於操作，在玻璃器皿內更易於適應，其性能（如所用的或可用的培養液、細胞的形態、細胞生長速度、細胞的保存等）是知道的，故較原代細胞常用。獸醫實驗診斷室最好備有傳代細胞，以便於從事病毒病的微生物學診斷。

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