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病毒學實驗技術(3)



錄入時間:2011-8-10 8:43:38 來源:百度

 

組織培養

培養病毒的組織培養技術,都是下列5種基本方法的改良:

(一)懸浮細胞培養法(Snspendedcell method  這是一個古老但現在仍在繼續

應用的方法,常用於口蹄疫病毒的培養。

(二)血漿凝塊培養法(Plasmadot method  應用凝固血漿(經常是雞血漿)使組織塊貼附在玻片或試管壁上。先在玻璃表麵塗布一層血漿膜,加入胚胎浸出液使其凝固。將組織塊置入這一基質內,即能貼附於玻璃表麵並增殖。應用這一方法可以看到細胞增殖,並可測量組織塊的生長情況。這類培養物中的病毒生長,可根據下列幾種方法測知:

a)取培養物的液體或細胞作為病毒樣品,接種於已知能發生感染的易感動物;(b)注意其對細胞代謝的影響(亦即對某些代謝路徑的抑製);(c)觀察細胞死亡(壞死);(d)檢測是否有血凝素存在;(e)對細胞或提純的液體進行電子顯微鏡檢查。

(三)單層細胞培養(Monolayer cell cultures  靜止的試管培養是病毒學中最常用的方法。這些培養物是用胰酶分散的組織製備的(來自適用的特殊來源,如腎、睾丸、皮膚、腫瘤以及其他組織)。這種培養物內含有小的細胞團塊和單個細胞。將組織用剪刀剪碎,並用鹽水衝洗,除去血細胞和細胞碎屑後將其置於胰酶溶液內,並用磁力攪拌裝置不斷攪拌。當細胞分散時(具體時間隨胰酶消化的溫度和所用組織而不同),稍予離心沉澱,用營養液衝洗23次,除去胰酶,用幾層紗布過濾後進一步稀釋,使每m1中含有足夠量的細胞,以保證良好的生長(細胞的具體數量隨細胞種類而不同),並分裝培養於試管內。

由腎組織製備的細胞懸液能在靜置的任何玻璃表麵(平皿或試管或玻璃瓶)產生豐盛的單層細胞。這樣製備的試管培養物可用於病毒的分離、滴定、中和試驗以及研究病毒在細胞內的生長。

(四)直接培養(Direct cultures  這種培養方法與單層細胞培養相同。在屍體剖檢時采取組織或者采取活體組織,用以製備單層細胞培養物,以提高病毒分離的機會,特別是在組織內的病毒可能很少或者因存在抗體而使病毒呈不活動狀態時。應用的胰酶應盡可能少,因為有些病毒可被胰酶滅活。

(五)器官培養(Organ cultures  用於接種可疑病毒材料的器官培養物,也可以如前所述那樣直接用病變組織製備。

現在最常用的是單層細胞培養,培養病毒以同種動物細胞為佳(即牛的病毒用牛的細胞),以腎細胞較常用,胚胎細胞較幼年動物的細胞好,幼年動物的細胞又較成年動物的細胞好。

細胞培養對玻璃器皿洗滌要求很高,徹底洗淨後用蒸餾水衝洗,再用雙餾水衝洗,幹燥滅菌後備用。所有溶液均用雙蒸餾水配製,所用藥品試劑要用高質量的分析純試劑。操作過程中,嚴格要求無菌。

 

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