1.範圍
本操作規程規定了霍亂病人、密接和帶菌者等糞便標本中的霍亂弧菌的檢驗方法。
2.檢驗依據
國家傳染病診斷標準：GB 15984—1995
衛生部疾病控製司《霍亂防治手冊》第五版
3.設備和材料
3.1 冰箱： -20℃～4℃。
3.2 恒溫培養箱： 36±1℃。
3.3 暗視野顯微鏡： 10×～100×。
3.4 架盤藥物天平： 0g～500g, 精確至0.5g。
3.5 錐形瓶： 100 mL、500 mL。
3.6 滅菌吸管： 1mL (具0.01mL刻度)、10mL (具0.1mL刻度)。
3.7 滅菌平皿： 直徑90 mm。
3.8 滅菌試管： 16 mm×160 mm.。
3.9 潔淨的載玻片。
3.10 潔淨的蓋玻片。
3.11 接種環。
3.12 生物安全櫃：Ⅱ級。
4.培養基和試劑
4.1堿性蛋白腖水。（pH8.4-8.6，8-10 mL）
4.2慶大黴素瓊脂。（培養基加熱煮沸3次；一份標本用一塊90mm平皿）
4.3霍亂弧菌診斷血清：Ｏ１群和Ｏ１３９群霍亂弧菌診斷血清（標明名稱、日期；稀釋後的診斷血清放4-8℃保存，當年使用；未稀釋的診斷血清冷凍保存，有效期內使用。）
5．檢驗程序:霍亂弧菌檢驗程序見圖1（略）。
6．操作步驟
6.1 快速試驗：為輔助診斷；其結果隻是初步報告，不是確診報告。
6.1.1 動力及動力抑製試驗：
6.1.1.1 如是急性期病人的水樣便或米泔樣便，則用接種環或滴管取1滴水樣便在玻片上然後蓋上蓋玻片，直接用暗視野顯微鏡觀察動力；或加生理鹽水1滴在玻片上，用接種環取成形便1環放置生理鹽水中研勻，蓋上蓋玻片直接用暗視野顯微鏡觀察動力；高度可疑的標本（就診前水樣便已服藥就診時為成形便）可取已增菌的堿性蛋白腖水1滴在玻片上然後蓋上蓋玻片，直接用暗視野顯微鏡觀察動力。如在鏡下見到穿梭樣運動（象夜空中的流星）即動力試驗陽性，否則陰性。
6.1.1.2 動力試驗陽性的標本，則各取O1和O139群霍亂弧菌診斷血清放置玻片上，取標本在血清中研勻（要求先取診斷血清再取標本，診斷血清與標本比例2：1），蓋上蓋玻片，用暗視野顯微鏡觀察是否有原來的穿梭樣運動，如穿梭樣運動已迅速停止並凝集成塊狀即動力抑製試驗陽性，否則陰性。
6.1.1.3 動力試驗和動力抑製試驗結果可口頭報告，但不能確診報告。雙陽時口頭報告轄區CDC高度可疑。
6.2 分離培養
6.2.1 糞便：所有病人糞便都應接種堿性蛋白腖水增菌37℃培養6～8h；未服藥急性期病人取水樣便或米泔樣便標本在堿性蛋白腖水增菌培養的同時可用接種環取一滿環或用棉拭子直接接種在慶大黴素瓊脂培養基上；增菌後平穩地從溫箱取出試管架，在菌膜下表層或菌液下表層取一接種環培養物，把接種環在試管壁上輕輕碰一下，待接種環上留有殘液後劃線接種慶大黴素瓊脂培養基，劃線時接種環在基線處反複多次劃線以接種的菌液幹了為準，最後用接種環從基線處開始不間斷劃線到完成。37℃過夜培養，不超過20h。
6.3 血清鑒定分型
6.3.1 血清玻片凝集試驗：挑取略帶灰色或青灰色、半透明、扁平、微隆起、光滑濕潤的可疑菌落與01群霍亂弧菌多價診斷血清及0139群霍亂弧菌診斷血清做玻片凝集試驗。要求每一平皿挑9-10個可疑菌落。如可疑菌落在血清中很快(一般在10s內)出現肉眼可見的明顯凝集顆粒，在生理鹽水中不凝集者判為陽性。均為陰性時方可報告未檢出01群及0139群霍亂弧菌。
7．質量控製
7.1用接種環取完標本、診斷血清、做完每一份標本實驗等，接種環應嚴格在酒精燈火焰上消毒，避免交叉汙染。
7.2玻片凝集試驗陽性時，一定同時做生理鹽水對照。在生理鹽水中不凝集者，方可判斷為陽性。
7.3 標本、增菌管、培養平皿要嚴格編號，標記清晰，避免結果錯報。
7.4診斷血清、培養基保存在指定溫度範圍內；診斷血清要在有效期內使用。
8．生物安全
8.1標本檢測要穿實驗專用服、戴口罩、帽子、手套，用過的口罩、帽子、手套放黃色汙物袋中，及時高壓處理。
8.2用過的玻片及時放入消毒缸中浸泡；實驗完畢，用浸泡消毒液的抹布擦拭實驗台麵，或紫外線照射消毒。
8.3 消毒製品要有有效的批準文號，在有效期內使用。 配製的消毒使用液，要表明配製日期。
8.4 標本、培養物、實驗廢棄物等，要經高壓消毒處理後，方可丟棄。
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