一、實驗目的
了解稀釋平板計數的原理，掌握塗抹平板培養法和混合平板培養法，認識細菌、放線菌、黴菌的菌落特征。
二、實驗原理
稀釋平板計數是根據微生物在固體培養基上所形成的單個菌落，即是由一個單細胞繁殖而成這一培養特征設計的計數方法，即一個菌落代表一個單細胞。計數時，首先將待測樣品製成均勻的係列稀釋液，盡量使樣品中的微生物細胞分散開，使成單個細胞存在（否則一個菌落就不隻是代表一個細胞），再取一定稀釋度、一定量的稀釋液接種到平板中，使其均勻分布於平板中的培養基內。經培養後，由單個細胞生長繁殖形成菌落，統計菌落數目，即可計算出樣品中的含菌數。此法所計算的菌數是培養基上長出來的菌落數，故又稱活菌計數。一般用於某些成品檢定（如殺蟲菌劑等）、生物製品檢驗、土壤含菌量測定及食品、水源的汙染程度的檢驗。
三、實驗器材
1．活材料：蘇雲金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）菌劑。
2．培養基：牛肉膏蛋白腖瓊脂培養基（附錄三、1）
3．器材：90ml無菌水、9ml無菌水、無菌平皿、lml無菌吸管、天平、稱樣瓶、記號筆、玻璃刮鏟等。
四、實驗方法
1．樣品稀釋液的製備 準確稱取待測樣品l
圖22-1 平板計數法中樣品的稀釋和稀釋液的取樣培養
用稀釋平板計數時，待測菌稀釋度的選擇應根據樣品確定。樣品中所含待測菌的數量多時，稀釋度應高，反之則低。通常測定細菌菌劑含菌數時，采用10-7、10-8、10-9稀釋度，測定土壤細菌數量時，采用10-4、10-5、10-6稀釋度，測定放線菌數量時，采用l0-3、10-4、10-5稀釋度，測定真菌數量時，采用10-2、10-3、10-4稀釋度。
2．平板接種培養 平板接種培養有混合平板培養法和塗抹平板培養法兩種方法。
（1）混合平板培養法 將無菌平板編上10-7、10-8、10-9號碼，每一號碼設置三個重複，用無菌吸管按無菌操作要求吸取10-9稀釋液各1ml放入編號10-9的3個平板中，同法吸取10-8稀釋液各lml放入編號10-8的3個平板中，再吸取10-7稀釋液各lml放入編號10-7的3個平板中（由低濃度向高濃度時，吸管可不必更換）。然後在9個平板中分別倒入已融化並冷卻至45—
（2）塗抹平板計數法 塗抹平板計數法與混合法基本相同，所不同的是先將培養基熔化後趁熱倒入無菌平板中，待凝固後編號，然後用無菌吸管吸取0.1ml菌液對號接種在不同稀釋度編號的瓊脂平板上（每個編號設三個重複）。再用無菌刮鏟將菌液在平板上塗抹均勻（圖22-3），每個稀釋度用一個滅菌刮鏟，更換稀釋度時需將刮鏟灼燒滅菌。在由低濃度向高濃度塗抹時，也可以不更換刮鏟。將塗抹好的平板平放於桌上20—30min，使菌液滲透入培養基內，然後將平板倒轉，保溫培養，至長出菌落後即可計數。
五、實驗作業：
將實驗結果填入下表中
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稀釋度 |
10-7 |
10-8 |
10-9 | |||||||||
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菌落數 |
1 |
2 |
3 |
平均 |
1 |
2 |
3 |
平均 |
1 |
2 |
3 |
平均 |
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計算結果時，常按下列標準從接種後的3個稀釋度中選擇一個合適的稀釋度，求出每克菌劑中的含菌數。
（1）同一稀釋度各個重複的菌數相差不太懸殊。
（2）細菌、放線菌、酵母菌以每皿30—300個菌落為宜，黴菌以每皿10—100個菌落為宜。
選擇好計數的稀釋度後，即可統計在平板上長出的菌落數，統計結果按下式計算。
混合平板計數法：
每克樣品的菌數=同一稀釋度幾次重複的菌落平均數×稀釋倍數
塗抹平板計效法：
每克樣品的菌數=同一稀釋度幾次重複的菌落平均數×10×稀釋倍數。
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