沙門氏菌回複突變實驗

 

目的：學習利用細菌檢測基因突變的方法 

Ames試驗  即鼠傷寒沙門氏菌營養缺陷型回複突變試驗，是目前檢測基因突變最常用方法之一。 

原理：利用鼠傷寒沙門氏菌突變株，即組氨酸缺陷型，其原始菌株菌體內的組氨酸是通過自身一係列酶催化反應合成的，這種能自身合成所需營養成份的菌株叫做野生型菌株。本試驗用鼠傷寒沙門氏菌為突變株，其不能合成組氨酸，而必須由外界提供這種菌珠被稱為營養缺陷式營養實變型（his-）。當誘變劑作用於菌株後，在菌株遺傳物質的特定位點發生基因回複突變成為野生型（his+），故在缺乏組氨酸的培養基上，隻存少數自發回變菌落生長，而能誘發細菌回變的致突變物可使細菌生長增多，從而可判斷被藥物是否具有致實變性。 

材料：菌株，鼠傷寒沙門氏菌TA97，TA98，TA100，TA102。 

器材：恒溫培養箱，幹燥箱，高壓消毒鍋，水溶鍋，紫外線燈（15w），藥物天平，分析天平 酒精燈，濾紙片，平皿，試管，燒杯，吸管。 

培養基配製 

1．Vogel-Bonner液10×（VB液10倍濃縮）用於配製底層基本培養基。配製方法：硫酸鎂（MgSO₄·7H₂O）1g，檸檬酸（C₆H₈O₇·H₂O）10g，磷酸氫二鉀（K₂HPO₄·3H₂O）65.5g，磷酸氫銨鈉（NaNH₄HPO₄·4H₂O）17.5g。將上述成分依次用蒸餾水溶解、混勻，然後加蒸餾水至500ml，置4℃冰箱保存。 

2．底層基本培養基  取VB液（10倍）100ml，加入蒸餾水800ml，用1mol/L NaOH調pH至7.0，然後加入瓊脂12—15g，經121℃20分鍾高壓滅菌。待冷至800C左右時，加入100ml已經112℃20分鍾高壓滅菌的20%葡萄糖液，混勻後澆製平板。 

3．上層培養基  D-生物素12.4mg，L-鹽酸組氨酸9.5mg，NaCl5g，瓊脂6g，上述成分依次加熱溶解，混合，然後加蒸餾水至1000ml。分裝後經121℃15分鍾高壓滅菌備用。 

方法 

1．藥物的劑量選擇 

對於易溶解的藥物，實驗最高劑量可采用抑菌濃度下的最大劑量，或以最大溶解度為最高劑量和5mg/皿為最高劑量，下設5個劑量，（即5000，500，50，5，0.5，0.1μg/皿）。溶劑：藥物是水溶性，可用滅菌蒸餾水，如非水溶性可選二甲亞碸為溶劑。 

2．平板摻入法 

每皿加底層培養20～25ml，待凝固。取融化並保溫於45℃的上層培養基，分裝於5ml試管中，每支試管2ml，依次加入新鮮菌液0.1ml， 藥物0.1ml，需加S9時則加入S9混合液0.3ml，混勻，迅速倒在底層培養基上，使之分布均勻。待上層瓊脂凝固後，翻轉平板置37℃培養48小時後，觀察結果。

觀察結果時，首先應觀察各實驗組和陰性對照的背景菌苔的生長情況。在肯定背景菌苔與陰性對照相差不多後，再比較各劑量組的回變菌落數。若回變菌落數的出現有劑量反應關係，回變菌落數大於自發對照的2倍或以上，結果並具有重現性，並有統計學意義的增加，可判斷為陽性，反之為陰性。

 

附錄：Ames 試驗記錄表，實驗者可視需要對表加快修改對所用菌株進行鑒定 

1．組氨酸營養缺陷（his^-）鑒定。取兩塊底層葡萄糖瓊脂平板，其中一塊加入0.1mol/L L 一組氨酸0.1mol和0.5mmol/L生物素0.1ml，另一塊（對照）隻加入生物素。用白金耳先在生物素對照平板上劃線，然後再在組氨酸/生物素平板上劃線，四種菌株可劃在同一平板上。在培養皿底部用標記筆注明每一菌株劃痕。翻轉平板，37℃培養24~48小時，觀察細菌生長情況。對照平板無細菌生長，含組氨酸平板應有細菌生長。 

2．深粗糙突變（rfa）鑒定—結晶紫抑菌試驗  加0.1ml等測菌液於裝有2ml上層培養基（融化後保持在45℃）的試管中，旋搖混勻後傾倒於營養瓊脂平板上，傾斜旋轉平板使之分布均勻。凝固後，將一滅菌濾紙片放在平板上，於紙片中心滴加1mg/ml結晶紫10μl，或先用滅菌濾紙片沾取結晶紫液，再放置平板上。倒置平板，在37℃培養12~24小時如在紙片周圍出現明顯的抑菌帶（約10mm），則表明有rfa突變存在。 

3．uvrB鑒定——紫外線敏感試驗  用滅菌拭子拈取測試菌株在營瓊脂平板上做平行劃線。有R因子的菌株（TA₉₇，TA₉₈，TA₁₀₀等）劃線在另外的平板上。用黑紙遮住無蓋平板的一半，另一半在距離33cm處，用一個15W紫外線燈照射，有R因子菌株照射8秒鍾。在同一平板上，應用時用切除修複功能的菌株（如TA₁₀₂）作為對照。平板照射後，在37℃培養1~24小時，具有uvrB缺陷的菌株，隻在未經照射的一側平板上生長。 

4．R因子（pKM101質粒）鑒定—抗氨苄青黴素試驗  用10μl左右氨苄青黴素（8mg/ml，0.02mol/L NaOH）在營養瓊脂平板上劃線，同時用等測菌液在同一平板上與氨苄青黴素交叉劃線。在同一平板上可鑒定幾種菌株，其中包括一種沒有R因子的對照菌株（如野生型），用以說明氨苄青黴素的效力。在37℃培養12~24小時，無R因子者在兩線交叉處出現抑菌，有R因子者則無抑菌現象。亦可仿照鑒定rfa突變的方法，用浸有氨苄青黴素的濾紙片貼在已接種R因子待測菌株的平板上。若紙片周圍無抑菌圈，則表明對氨苄青黴素有抗性，即R因子存在。 

5．pAQ1質粒鑒定——抗四環素試驗  方法類似R因子鑒定，四環素濃度為8mg/ml，0.02mol/L HCl，用量10μl。 

6．自發回變鑒定  加0.1ml待測菌液於含有2ml上層培養基的試管中，混勻後鋪倒在底層基本培養基上。37℃培養24小時，計數每皿自發的回變菌落數。 四種標準菌株的回變菌落數（不加S9）

 

營養肉湯配製（增藥用），氯化鈉0.5g、牛肉膏0.5g、蛋白腖1.0g、雙蒸水100ml，溶解後，用4N NaOH調pH至7.2 ，15磅滅菌20分鍾，備用。