植物組織培養及其應用（2）

 

　　（二）組織的分化與器官建成 

　　1、維管組織的分化 

　　早期研究發現（Wetmore，1955），丁香的芽可以誘導鄰近的組織分化出維管束，後證明這是芽中IAA的作用。將一塊含有14C-IAA和蔗糖的瓊膠楔形物插入到愈傷組織切口中，14C-IAA表明蔗糖和IAA通過瓊膠擴散到愈傷組織，從而在愈傷組織中造成這兩種物質的梯度，在楔形物一頗有同感形成維管束的瘤狀物，瘤狀物含有一形成層帶，一麵形成韌皮部，一麵形成木質部，與正常的維管束有類似的排列。增加IAA的濃度，導致木質部形成，增加蔗糖濃度則導致韌皮部形成。生長素水平恒定時，2%蔗糖則全部分化出木質部，4%蔗糖幾乎全部分化出韌皮部，3%蔗糖則可以分化出二者。所以，生長素和蔗糖濃度決定愈傷組織中維管束的類型與數量。 

　　Rier和Beslow進一步報道，蔗糖不僅影響細胞的數目，而且影響其結構。低濃度蔗糖（0.5%）誘導出環紋和梯紋管胞，1.5-3.-5%蔗糖誘導出梯紋和網紋細胞。 

　　細胞分裂素類對促進木質部形成也有作用。它們使碳水化合物代謝趨向於五碳糖途徑，促進木素前體苯丙烷的合成，不同的細胞分裂素作用不同。玉米素>激動素>6-BA（6-苄基腺嘌呤），NAA/激動素的比值為0.5/20時有木質部發生和根形成，而比值降為0.025/0.4時，隻發生木質部而不發生根，赤黴素（GA）、乙烯、脫落酸對木質部發生有抑製作用。 

　　2、根和芽的分化 

　　外植體誘導出愈傷組織後，經過繼代培養，可以在愈傷組織內部形成一類分生組織（meristemoid）即具有分生能較往年小細胞團，然後，再分化成不同的器官原基。有些情況下，外植體不經愈傷組織而直接誘導出芽、根。所以器官發生有兩種方式，即直接和間接的。 

　　（1）外植體→器官發生（根、芽或胚狀體）→再生植株。 

　　（2）外植體→愈傷組織→類分生組織→根、芽→再生植株。 

　　根是組織培養中易形成的器官，早在30年代，就看以胡蘿卜培養物中根的形成，以後又在多種植物中看到，同一植物不同器官可以誘導出根來：如棉花幼苗子葉、下胚軸切段、油菜葉片、葉柄、下胚軸等，多種植物愈傷組織也易生根。 

　　形成芽的培養基條件常有不同，有時芽與根可以同時在組織培養中形成，一般說，培養物中形成的芽如胡蘿卜懸浮培養，油菜愈傷組織等。在組織培養中通過根、芽誘導再生植株方式有三種：一種在芽產生之後，於芽形成的基部長根而形成小植株，一種是在根上生長出芽來，另一種即在愈傷組織的不同部位分別形成芽和根，然後兩者結合起來形成一株植物。 

　　除營養芽之外，在組織培養中有時也有花芽的形成，如煙草、花生等。也有變態器官的形成，如百合鱗片切塊分化出的芽，形成小鱗莖，唐菖蒲莖端可誘導形成小球莖，馬鈴薯的莖切段可以形成塊莖。 

　　植物激素的成分影響著器官建成， Skoog和Miller等所提出的生長素和激動素比例決定根和芽分化的觀點，曾被大量的試驗結果所證明。 

　　在很多禾穀類作物的組織培養中發現，用較高濃度的生長素（2，4-D）誘導形成的愈傷組織，當培養在除去生長素，或適當濃度的活性較低的生長素中時，就可以誘導芽的形成。Nitsch等用Linsmaier(LM)培養基附加10-5摩爾2，4-D培養水稻愈傷組織可以生根，一旦轉入無生長素的培養基時就能產生芽。Rangan將小米愈傷組織從含生長素的培養基轉移到無生長素的培養基，一個星期內就形成了芽。 

　　但在另一些例子中激素比例控製器官分化的問題則出現完全相反的情況。苜蓿在有2，4-D和細胞分裂素的培養基中，可以形成愈傷組織，轉入不加以上兩種激素的培養基中能分化，但分化的情況與原來的激素比例有關。如果愈傷組織是在高細胞分裂素/生長素比例的培養基中形成的，易於生根，而在高生長素/細胞分裂素比例的培養基中形成的，易於生根，而在高生長素/細胞分裂素比例的培養基中形成的愈傷組織，則易生芽。由此看來，分化與激素的關係同植物的遺傳性有著密切的關係，用五個品種的煙草做實驗，用相同的生長素/細胞分裂素比例，結果有的品種形成很多芽，有的形成很少芽，有的完全不生芽。 

　　培養基的物理因素和外界條件對器官建成有一定影響。固體培養基有利於誘導愈傷組織，而液體培養基有利於細胞和胚狀體增殖。藍光有利於芽的分化，而紅光、遠紅光對芽分化有抑製作用，但促進根分化，紫光對生芽有刺激作用。石刁柏、虎耳草屬、鳳梨科植物分化前期需要低光強（1000勒克斯），後期要求高光強（3000-10000勒克斯），降低氧濃度促進胡蘿卜愈傷組織芽的形成，增加氧濃度促進不定根形成。 

　　3、胚狀體是指在組織培養呂從一個非合子細胞，通過合子胚相似的胚胎發生過程所形成的胚狀結構。從胚狀體可以形成完整的植株，這是植株細胞全能性的最強有力的一個證據。 

　　50年代末期，Steward等人從胡蘿卜的韌皮部用液體培養基通過遊離細胞的分化，獲得了胚狀體。據統計，在植物組織培養中具有胚狀體分化能力的種子植物已達117種，分屬43科，75屬。 

　　在植物組織組織培養中，誘導胚狀體與誘導芽相比較，具有顯著的優點，一是數量多，二是速度快，三是成苗率高。由於胚狀體具有這些優點，所以在育種工作及園藝工作中，可用胚狀體作為特定的優良基因型個體的無性繁殖手段，同時在研究胚胎發育中也有很重要的理論意義。 

　　培養基的激素成分和氮源影響胚狀體的發生。有的植物可在無激素培養基上誘導出胚狀體，如煙草、曼陀蘿、水稻、小麥花藥培養；有的植物需要生長素與細胞分裂素的一定比例誘導胚狀體，如油茶、酸棗、桃等。石龍芮下胚軸，石刁柏愈傷組織，還有一些植物先在有激素的培養基上，然後轉入無激素培養誘導胚狀體。有人證明培養基中還原態氮對胚狀體有利，但我國使用的N5培養基硝酸鹽含量高，也有很好的作用。水解酪蛋白或多種氨基酸對胚狀體發生有促進效應。 

胚狀體的發生還與外植體來源和年齡、培養的時間、植物的遺傳型等因素有關。