組織培養技術

 

所謂組織培養就是將植物的各類器官組織作為外植體,接種於人工配製的培養基上,並配合一定的營養、激素、溫度、光照等條件,以無菌培養方式增殖的一種生物技術. 植物組織培養是在無菌條件下，將植物體的一個器官，如根尖、莖尖、葉、花、未成熟的果實、種子等，或一種組織，如形成層、花藥組織、胚乳、皮層等，或單個細胞，如體細胞、生殖細胞等，或胚胎，如成熟和未成熟的胚，或原生質體，如脫壁後仍具有生活力的原生質體，從植物體取出後，放在潔淨容器內的人工配製的培養基上，給予適宜的培養條件，使它們得以繼續生存或發展，誘發產生愈傷組織、潛伏芽、不定芽、不定根等，或長成完整的植株，統稱為植物組織培養。由於是在試管內培養，而且培養的是脫離植物母體的培養物，因此也稱離體培養和試管培養。根據外植體來源和培養對象的不同，又分為植株培養、胚胎培養、器官培養、組織培養、原生質體培養等。植物組織培養技術是近代生物科學發展起來的一門新技術，是生物技術(即生物工程)的主要組成部分，是在超淨的組培室中快繁脫毒即工廠化的栽培室中進行的規模生產。自哈布蘭特(G.Haberlandt) 1902年提出植物細胞的全能性，即每個植物的本細胞或性細胞都具有該植物的全套遺傳基因，因此在一定培養條件下每個細胞都可發育成一個與母體一樣的植株。這個概念雖然在上世紀初已經提出，但在當時的技術條件下，在實踐上並沒做到。經過80多年來無數科學家的努力，組織培養技術得到不斷改進，技術趨於完善、成熟，目前細胞的全能性不但在理論上完全被證實，而且為組織培養在實踐上的應用奠定了基礎。植物組織培養已遍地開花，在世界各地進展很快。培養的材料有莖尖、根尖、花粉、花藥、葉原基、愈傷組織、細胞等，已經培養成功的植物有近千種。

 

1、花卉組織培養對實驗室及設備的要求 

　　花卉組織培養是在人工控製的條件下培養花卉，是一種花卉現代工廠化生產新技術，所以其對實驗室及設備有一定的要求。 

　　實驗室方麵 

　　①化學實驗室：主要承擔配製培養基的任務。要求具有各種化學藥品試劑、各種玻璃器皿、稱量天平等。 

　　②洗滌室：主要進行玻璃器皿的洗滌，要求有自來水裝置，同時有烘箱，以便洗後烘幹。 

　　③滅菌室：主要進行培養基和用具的消毒。要有高壓滅菌鍋，具有水源和電源。 

　　④接種室：是花卉材料分離、消毒接種和轉移的場所。要求密閉、清潔、整齊、裝有紫外燈，能隨時滅菌。有的也可用接種箱或超淨工作台代替。 

　　⑤培養室：是花卉材料培養生長的地方。要求清潔，保溫好，室溫均勻一致，並有絕熱、防火性能。 

　　設備方麵 

　　①天平：供配製培養基時稱量藥品和激素用。大量元素用普通天平；微量元素和激素用分析天平。 

　　② 酸度計：測定培養基的pH用。 

　　③高壓滅菌鍋：是供培養基和器械用具滅菌用。 

　　④烘箱：洗淨的玻璃器皿幹燥滅菌用。 

　　⑤蒸餾水製造裝置：得到純淨水供培養用。 

　　⑥冰箱：供貯放母液和植物材料用。 

　　⑦接種箱或超淨工作台：為植物材料接種或轉移的操作場所。 

　　⑧空調機：控製室溫用。

 

3、花卉組織培養對培養基的要求 

　　培養基是花卉植物組織培養中十分重要的基質，目前應用的有好多種，但其主要成分大體相同，主要成分是水，其他還有大量元素、微量元素、維生素、生長調節物質、蔗糖和瓊脂等。 

花卉組織培養中應用最多的為MS培養基。其組成是在配製1升（1000毫升）培養基時，加硝酸銨1.65克、硝酸鉀1.9克、氯化鈣0.44克、硫酸鎂0.37克、磷酸二氫鉀0.17克、碘化鉀0.83毫克、硼酸5.2毫克、硫酸鎂22.3毫克、硫酸鋅3.6毫克、鉬酸鈉0.25毫克、硫酸銅0.025毫克、氯化鈷0.025毫克、硫酸鐵27.8毫克、蔗糖30克和瓊脂7克。其他生長調節物質要根據花卉的種類和培養目的而確定。MS培養基中大量元素濃度過高，為此常采用1/2、1/4大量元素濃度作培養用，這樣生長效果列好。 

　　配製培養基前要準備好三角瓶、試管、燒杯、量筒、吸和等玻璃器皿，預先稱好藥品。配製時先將瓊脂溶化，再加入在水中深解的各種營養元素和蔗糖，然後用氫氧化鈉或鹽酸調整培養基的pH，一般掌握在5.7左右。以後可分注到養瓶中，蓋好瓶蓋。培養基配好要經高壓滅菌。冷卻後放到培養室預培養3天，如沒有雜菌汙染，才可進行花卉材料的接種。

 

3、花卉組織培養的過程  

　　花卉植物組織培養即無菌培養，也就是要求培養的材料不帶有雜菌。從田間或溫室等地切取花卉材料時，應選擇健壯無病蟲母株，取幼嫩、分生能力強的部位，以利生長。 

　　取來的材料雖經選擇，外部總還有不少雜菌。為此，接種前應進行表麵滅菌。通常先用自來水衝洗十幾分鍾，有泥的應刷去。衝洗幹淨後，用70%的酒精浸泡10-15秒鍾消毒。接著用無菌水（經高壓滅菌的蒸餾水）衝洗兩次，再用10%的漂白粉澄清液浸泡20分鍾消毒，最後用無菌水衝洗3-4次。帶有茸毛不易濕潤消毒的材料可加些洗衣粉。上述操作皆應在接種箱或超淨工作台等無菌環境條件進行。經過表麵滅菌的材料，用無菌濾紙將水吸掉。再用解剖刀切取所需部位，通常幾毫米大小，培育無病毒苗則應在1毫米以下，然後用解剖針或槍式鑷子將材料接種到培養瓶上培養。工具用完即應在95%酒精中蘸一下，或用火焰消毒法消毒，避免工具帶菌造成交叉汙染。操作時應穿工作服、戴工作帽，事先洗淨手，後再用酒精棉擦試一遍

 

4、花卉組織培養材料的培養和移植

 

　　花卉材料接種後放到培養室培養。培養室是花卉材料培養生長的場所，一般幾到十幾平方米皆可。高度約2米左右，空間小，可節省控溫能源。培養材料放在培養架上培養。培養架可有木材或金屬製成，有4-5層，每層高40-50厘米，日光燈裝在上方。架長1.2米左右，與40瓦日光燈長一致，寬80-90厘米。每一層可裝兩支日光燈，這樣培養時的照度約為3000勒克斯。培養室的溫度大多采取晝夜恒溫培養，保持在25℃±2℃，也有采取晝夜變溫培養的，夜晚溫度可低些，這應根據花卉生長需要而定。每天日光燈照明12-16小時。

 

　　花卉試管苗由於人工提供各方麵優越條件，一般生長發育好，根係也多，可往往由於沒掌握其特性，造成移栽時成活率不高。這是因為試管苗在瓶中濕度很高的條件下培養，人為提供蔗糖等碳源，花卉材料是處一起異養生活狀態，可以說比溫室生長的花卉還要嬌嫩得多。而突然從瓶中移到土壤讓其過自養生活，往往由於變化太劇烈而造成損傷甚至死亡。為此，花卉試管苗開始移出時，仍應罩上玻璃瓶，或蓋上薄膜袋（上開幾個小孔），1周後去掉。有噴霧條件則更理想。開始7-10天要遮蔭，以後逐漸見陽光。移植基質以沙與蛭石各半為好，要排水、通風好，隔一天澆一次營養液。這樣逐步鍛煉，讓其適應環境。2-3周後經馴化鍛煉苗即可移至培養土中栽植

 

5組培技術在花卉生產上的應用主要是：

 

a、快速、大量繁殖優良品種

 

組織培養與傳統的無性繁殖相比，工作不受季節限製，而且經過組織培養進行無性繁殖具有用材少、速度快等特點，對一些難繁殖的名貴品種花卉及一些短期內大量急需生產的花卉應用很廣，如蘭花、菊花、唐菖蒲等花卉利用腋芽增生，短期可得到大量植株，非洲紫羅蘭可通過葉片，水仙可通過鱗片，誘導產生不定芽，達到大量繁殖的目的。

 

b、花卉的育種

 

在花卉育種上，主要在胚胎培養、單倍體育種、體細胞雜交和植物基因工程等方麵應用較多，此外還可采用愈傷組織誘變、花粉培養等多種方法來進行花卉育種。通過組織培養，可縮短育種年限和世代，也有利於基因突變中隱性突變的分離。百合、鳶尾等許多花卉可以進行遠緣雜交，由於生理代謝等方麵的原因，常使雜種胚早期敗育，因而得不到雜種植物。而在試管中進行胚培養，可使其順利生長，得到遠緣雜種。

 

c、花卉的提純複壯

 

運用組織培養，苗木的複壯過程很明顯，對於長期運用無性方法繁殖並開始退化的花卉品種，如康乃馨采用組培方法繁殖，可使個體發育向年輕階段轉化。

 

d、獲得無病植株

 

一些用無性繁殖方法來繁衍的花卉種類如康乃馨、菊花、鬱金香、唐菖蒲、水仙、百合、鳶尾、大麗花等，靠無性繁殖不能通過種子途徑去除病毒，病毒逐代傳遞積累，危害日趨嚴重，影響了花卉的觀賞效果。而花卉植物0.1～0.5mm大小的生長點區幾乎不含或含極少病毒，因為該區無維管束，病毒難以進入，把這個區從植株母體分離培養，得到的基本上是無病毒苗，為獲得無病毒植株的重要途徑。

 

e、種質資源的保存

 

很多無性繁殖的植物因沒有種子，無法長期保存，其種質資源傳統上隻能在田間種植保存，耗費人力物力，且資源易受人為因素和環境因素影響而丟失。而用組培方法保存，可大大節省人力、物力，並延長保存期，保證種質資源不會突變和流失。

 

6 組織培養技術具有如下特點：

 

繁殖要在嚴格控製下完成，進行時所需材料少，但繁殖速度快，繁殖係數高。如一年內一個蘭花莖尖可繁殖出100萬以上的植株；且繁殖周期短，一般30天左右即為一個周期；可全年生產，打破傳統“靠天吃飯”的模式，不受季節影響，可按市場需要組織生產；可機械化，自動化、工業化生產，占地麵積小；種苗質量好、無病菌，無病毒，遺傳性能穩定，還不易受病蟲害侵染；組培苗無性係的性狀比傳統無性係的性狀更加一致；便於交流和打入國際市場；與其它生物技術相比，本項技術所需成本低，利潤回報率高，但初期投資多，技術難度高。

 

組培苗具有無雜菌、優質、均勻、分蘖性強、繁殖率高、批量生產、周年供應、便於運輸等優點。由於病毒的侵染，許多花卉的產量、質量不斷下降，采用莖尖脫毒的技術，可以使病株複壯，經過脫毒的植株健壯、產量高、質量好、花色純正，因此近年來花卉組織培養及快繁脫毒技術越來越多地應用於花卉種苗繁殖生產中。目前，利用植物的一小塊組織，如生長尖、葉片、莖段、側芽等作為培養材料，在特定的培養環境中，幾個月就可以培養出成千上萬株與原來植物完全相同的植物

 

7 前景

 

本技術應用範圍廣，不受地區限製，適用於各地花卉生產區、種苗場。生產單位可免除育苗工序，大大縮短栽培周期，減少溫室土地、設備、勞力等資源的閑置和浪費，提高了花卉質量，使同樣麵積的土地和勞動力產生的效益成培增加，比使用常規方法繁育的花卉種苗生產的鮮切花，每畝效益增加35％～50％。花卉消費是物質文明和精神文明的象征，花卉業是一項新興產業，是今後最有發展的十大行業之一，許多發達國家的大中城市數量最多的商店要數花店了。在我國隨著人民生活水平和文化素養提高，花卉消費這一時尚已逐步進入家庭，這是一個巨大的消費市場。全國各地興起許多花卉交易市場，對這種發展趨勢又起著推波助瀾的作用。

 

目前，生物技術正在世界突飛猛進地發展，在醫學、農業、食品工業、能源工業、環境保護各個領域表現出極大的生產潛力。作為生物技術有力手段的組織培養也日益受到重視，在農林作物的脫毒快繁、突變誘發、細胞工程和基因工程等方麵都可以發揮作用。

 

近40年來，植物組織培養技術得到了迅速發展，已滲透到植物生理學、病理學、藥學、遺傳學、育種以及生物化學等各個研究領域，成為生物學科中的重要研究技術和手段之一，並廣泛應用於農業、林業、工業、醫藥業等多種行業，產生了巨大的經濟效益和社會效益，已成為當代生物科學中最有生命力的一門學科。對農業、林業、蔬菜、果樹、花卉以及藥用植物新品種培育、品種脫毒、提純複壯、快速無性繁殖、擴大種苗生產等方麵均產生了劃時代影響。