一、實驗目的與要求：
（1） 熟悉玻璃器皿的洗滌包裝和滅菌前的準備工作。
（2） 學習微生物培養基和無菌水的製備，了解培養基配方中各成分的作用、製備流程及各環節的操作技術與應用。
（3） 學習並掌握培養基的高壓蒸氣滅菌原理、操作關鍵技術和滅菌技術。
二、實驗原理
培養基的製備原理
培養基是按照微生物生長發育的需要，用不同組分的營養物質調製而成的營養基質。人工製備培養基的目的，在於給微生物創造一個良好的營養條件。把一定的培養基放入一定的器皿中，就提供了人工繁殖微生物的環境和場所。自然界中，微生物種類繁多，由於微生物具有不同的營養類型，對營養物質的要求也各不相同，加之實驗和研究上的目的不同，所以培養基在組成原料上也各有差異。但是，不同種類和不同組成的培養基中，均應含有滿足微生物生長發育的水分、碳源、氮源、無機鹽和生長素以及某些特需的微量元素等。此外，培養基還應具有適宜的酸堿度(pH值)和一定緩衝能力及一定的氧化還原電位和合適的滲透壓。
根據製備培養基對所選用的營養物質的來源，可將培養基分為天然培養基、半合成培養基和合成培養基三類。按照培養基的形態可將培養基分為液體培養基和固體培養基。根據培養基使用目的，可將培養基分為選擇培養基、加富培養基及鑒別培養基等。
培養基的類型和種類是多種多樣的，必須根據不同的微生物和不同的目的進行選擇配製，本實驗分別配製常用培養細菌、放線菌和真菌的牛肉膏蛋白腖培養基、高氏一號合成培養基和馬鈴薯蔗糖培養基等固體培養基。
固體培養基是在液體培養基中添加凝固劑製成的，常用的凝固劑有瓊脂、明膠和矽酸鈉，其中以瓊脂最為常用，其主要成份為多糖類物質，性質較穩定，一般微生物不能分解，故用凝固劑而不致引起化學成份變化。瓊脂在95℃的熱水中才開始融化，融化後的瓊脂冷卻到45℃才重新凝固。因此用瓊脂製成的固體培養基在一般微生物的培養溫度範圍內(25℃-37℃)不會融化而保持固體狀態。
高壓蒸氣滅菌原理
高壓蒸汽滅菌是將待滅菌的物品放在一個密閉的加壓滅菌鍋內，通過加熱，使滅菌鍋隔套間的水沸騰而產生蒸汽。待水蒸汽急劇地將鍋內的冷空氣從排氣閥中驅盡，然後關閉排氣閥，繼續加熱，此時由於蒸汽不能溢出，而增加了滅菌器內的壓力，從而使沸點增高，得到高於100℃的溫度。導致菌體蛋白質凝固變性而達到滅菌的目的。
在同一溫度下，濕熱的殺菌效力比幹熱大，其原因有三：一是濕熱中細菌菌體吸收水分，蛋白質較易凝固，因蛋白質含水量增加，所需凝固溫度降低(表Ⅴ-2)，二是濕熱的穿透力比幹熱大(表Ⅴ-3)；三是濕熱的蒸汽有潛熱存在，每1克水在100℃時，由氣態變為液態時可放出2.26kJ(千焦)的熱量。這種潛熱，能迅速提高被滅菌物體的溫度，從而增加滅菌效力。
表Ⅴ-2 蛋白質含水量與凝固所需溫度的關係
|
卵自蛋白含水量(%) |
30分鍾內凝固所需溫度(℃) |
|
50
25
18
6
0 |
56
74-80
80-90
145
160-170 |
表Ⅴ-3 幹熱與濕熱穿透力及滅菌效果比較
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溫 度 (℃) |
時間(小時) |
透過布層的溫度(℃) |
滅 菌 |
|
20層 |
40層 |
100層 |
|
幹熱 130-140 |
4 |
86 |
72 |
70.5 |
不完全 |
|
濕熱 105.3 |
3 |
10l |
10l |
10l |
完 全 |
在使用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌時，滅菌鍋內冷空氣的排除是否完全極為重要，因為空氣膨脹壓大於水蒸汽的膨脹壓，所以，當水蒸汽中含有空氣時，在同一壓力下，含空氣蒸汽的溫度低於飽和蒸汽的溫度。滅菌鍋內留有不同分量空氣時，壓力與溫度的關係見表Ⅴ-4。一般培養基用1.05kg/cm2，121.3℃ 15-30分鍾可達到徹底滅菌的目的。滅菌的溫度及維持的時間隨滅菌物品的性質和容量等具體情況而有所改變。例如含糖培養基用0.56kg/cm2(8磅/英寸2)，112.6℃滅菌15分鍾，但為了保證效果，可將其他成分先行121.3℃，20分鍾滅菌，然後以無菌操作手續加入滅菌的糖溶液。又如盛於試管內的培養基以1.05kg/cm2，121.3℃滅菌20分鍾即可，而盛於大瓶內的培養基最好以1.05kg/cm2滅菌30分鍾。
表Ⅴ-4滅菌鍋內留有不同分量空氣時，壓力與溫度的關係
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壓 力 數 |
全部空氣排出時的溫度 (℃) |
2/3空氣排出時的溫度(℃) |
l/2空氣排出時的溫度 (℃) |
1/3空氣排出時的溫度 (℃) |
空氣全不排出時的溫度 (℃) |
|
千克
(公斤/ 厘米2)
(kg/cm2) |
磅/英寸2
(1b/in2) |
|
0.35
0.70
1.05
1.40
1.75
2.10 |
5
10
15
20
25
30 |
108.8
115.6
121.3
126.2
130.0
134.6 |
100
109
115
121
126
130 |
94
105
112
118
124
128 |
90
100
109
115
121
126 |
72
90
100
109
115
121 |
蒸汽壓力所用單位為kg/cm2(千克/厘米2)，它與1b/in2(磅/英寸2)和溫度的換算關係見表Ⅴ-5。
表Ⅴ-5 蒸汽壓力與蒸汽溫度換算關係
|
蒸汽壓力
大氣壓 |
壓 力 表 讀 數 |
蒸汽溫度 |
|
kg/cm2 |
1b/in2 |
|
1.00
1.25
1.50
1.75
2.00
2.50
3.00 |
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.50
2.00 |
0.00
3.75
7.50
11.25
15.00
22.50
30.00 |
100.0
107.0
112.0
115.0
121.0
128.0
134.5 |
三、實驗器材
1、 藥品瓊脂，10％HCL,10% NaOH，牛肉膏蛋白腖培養基的配方藥品；
2、 材料具刻度1000毫升塘瓷盅或小鋁鍋，電子稱，10×200mm試管，量筒，小燒杯，玻璃棒，骨匙，pH試紙，分裝漏鬥，試管盒，紗布，棉花，報紙，麻繩，標簽，培養皿。
3、 設備高壓蒸汽滅菌鍋、烘箱、冰箱、電爐等
四、實驗步驟
1、 稱取藥品放在大燒杯中，加入蒸餾水用玻璃棒攪拌並加熱溶化，等藥品溶解後用pH試紙調節p H至7.4-7.6，如有沉澱應過濾後分裝，每支試管約加入9ml。每組分裝30支，加上棉塞，包上牛皮紙，準備滅菌。
裝入試管中的量不宜超過試管高度的1/5，裝入三角燒瓶中的量以燒瓶總體積的一半為限。在分裝過程中，應注意勿使培養基沾汙管口或瓶口、以免弄濕棉塞，造成汙染。
2、無菌水準備
在試管或瓶內先盛以適量的蒸餾水〔或生理鹽水O．85％NaCl)，蓋好棉塞，包上牛皮紙使其滅菌後，其水量恰為9ml。 每組準備10支與牛肉膏蛋白腖培養基可放在同一試管架上，以一大張牛皮紙包紮寫上姓名。準備滅菌。
3、高壓滅菌
手提式高壓蒸汽滅菌鍋的使用操作步驟：
（1）首先將內層滅菌桶取出，再向外層鍋內加入適量的水，使水麵與三角擱架相平為宜。
（2）放回滅菌桶，並裝入待滅菌物品。注意不要裝得太擠，以免防礙蒸汽流通而影響滅菌效果。三角燒瓶與試管口端均不要與桶壁接觸，以免冷凝水淋濕包口的紙而透入棉塞。
（3）加蓋，並將蓋上的排氣軟管插入內層滅菌桶的排氣槽內。再以兩兩對稱的方式同時旋緊相對的兩個螺栓，使螺栓鬆緊一致，勿使漏氣。
（4）用電爐或煤氣加熱，並同時打開排氣閥，使水沸騰以排除渦內的冷空氣。待冷空氣完全排盡後，關上排氣閥，讓鍋內的溫度隨蒸汽壓力增加而逐漸上升。當鍋內壓力升到所需壓力時，控製熱源，維持壓力至所需時間。本實驗用1.05kg/cm2，121.3℃，20分鍾滅菌。
（5）滅菌所需時間到後，切斷電源或關閉煤氣，讓滅菌鍋內溫度自然下降，當壓力表的壓力降至0時，打開排氣閥，旋鬆螺栓，打開蓋子，取出滅菌物品。如果壓力未降到0時，打開排氣閥，就會因鍋內壓力突然下降，使容器內的培養基由於內外壓力不平衡而衝出燒瓶口或試管口，造成棉塞沾染培養基而發生汙染。
（6）將取出的滅菌培養基放入37℃溫箱培養24小時，經檢查若無雜菌生長，即可待用。
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