微生物細胞的顯微直接計數法

 

了解血球計數板的構造、計數原理和計數方法，用顯微鏡直接測定微生物總細胞數。

 

測定微生物細胞數量的方法很多，通常采用的有顯微直接計數法和稀釋平板計數法。

 

直接計數法適用於各種單細胞菌體的純培養懸浮液，如有雜菌或雜質，則難於直接測定。菌體較大的酵母菌或黴菌孢子可采用血球計數板，一般細菌則采用彼得羅夫·霍澤(Petrof Hausser)細菌計數板。兩種計數板的原理和部件相同、隻是細菌計數板較薄，可以使用油鏡觀察。而血球計數板較厚，不能使用油鏡，計數板下部的細菌難於區分。

 

血球汁數板是一塊特製的厚型載玻片，載玻片上有4條槽所構成的3個平台。中間的平台較寬，其中間又被一短橫槽分隔成兩半，每個半邊上麵各有一個計數區，計數區的刻度應有兩種：一種是計數區分為16個大方格(大方格用三線隔開)，而每個大方格又分成25個小方格；另一種是一個計數區分成25個大方格(大方格之間用雙線分開)，而每個大方格又分成16個小方格。但是不管計數區是哪一種構造，它們都有一個共同特點，即計數區都由400個小方格組成。

 

計數區邊長為1mm，則計數區的麵積為1mm²，每個小方格的麵積為1/400mm²。蓋上蓋玻片後，計數區的高度為0.1mm，所以計數區的體積為0.1mm³，每個小方格的體積為1／4000mm³。

 

使用血球計數板計數時，先要測定每個小方格中微生物的數量，再換算成每mL菌液(或每g樣品)中微生物細胞的數量。

已知：1mL體積＝10mm×10mm×10mm＝1000mm³

 

所以：1mL體積應含有小方格數為1000mm³／(1／4000mm³)＝4x10⁶個小方格。即係數K＝4x10⁶。因此：每mL菌懸液中含有細胞數=每個小格中細胞平均數(N) x係數(K) x菌液稀釋倍數(d)。

 

(1)活材料：釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae )斜麵菌種或培養液。

 

(2)器材：顯微鏡、血球計數板、蓋玻片(22mm x 22mm)、吸水紙、計數器、滴管、擦鏡紙。

 

 

(1)視待測菌懸液濃度，加無菌水適量稀釋(斜麵一般稀釋到10^-2)，以每小格的菌數可數為度。

 

(2)取潔淨的血球計數板一塊，在計數區上蓋上一塊蓋玻片。

 

(3)將酵母菌懸液搖勻，用滴管吸取少許，從計數板中間平台兩側的溝槽內沿蓋玻片的下邊緣滴入一小滴(不宜過多)，讓菌懸液利用液體的表麵張力充滿計數區，勿使氣泡產生，並用吸水紙吸去溝槽中流出的多餘菌懸液。也可以將菌懸液直接滴加在計數區上，注意不要使計數區兩邊平台沾上菌懸液，以免加蓋蓋玻片後，造成計數區深度的升高。然後加蓋蓋玻片(勿使產生氣泡)。

 

(4)靜置片刻，將血球計數板置載物台上夾穩，先在低倍鏡下觀察到計數區後，再轉換高倍鏡觀察並計數。由於活細胞的折光率和水的折光率相近，觀察時應適當關小孔徑光闌並減弱光照的強度。

 

(5)計數時若計數區是由16個大方格組成，按對角線方位，數左上、左下、右上、右下的4個大方格(即100小格)的菌數。如果是25個大方格組成的計數區．除數上述四個大方格外，還需數中央1個大方格的菌數(即80個小格)。如菌體位於大方格的雙線上，計數時則數上線不數下線，數左線不數右線，以減少誤差。

 

(6)對於出芽的酵母菌，芽體達到母細胞大小一半時，即可作為兩個菌體計算。每個樣品重複計數2—3次(每次數值不應相差過大，否則應重新操作)，求出每一個小格中細胞平均數(N)，按公式計算出每mL(g)菌懸液所含酵母菌細胞數量。

 

(7)測數完畢，取下蓋玻片，用水將血球計數板衝洗幹淨，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免損壞網格刻度。洗淨後自行晾幹或用吹風機吹幹，放入盒內保存。