一、實驗目的
1、了解人工培養基的主要成分及一般製備原則。
2、掌握基礎培養基的製造方法和過程。
二、實驗原理
培養基是人工配製的適合微生物生長繁殖的營養基質。培養基要具備以下條件：①要有適宜的營養物質和水分；②具有適宜的PH值；③配製後應經滅菌呈無菌狀態。
培養基按物理狀態可分液體培養基、固體培養基、半固體培養基。常用瓊脂作凝固劑。
培養基製備的基本程序：配料、溶化、測定及矯正PH、過濾、分裝、滅菌、無菌檢驗
三、儀器設備
試管、刻度吸管、紗布、濾紙、三角瓶、培養皿、量筒、漏鬥、棉塞、電爐、天平、包裝紙、棉線、ph試紙、玻棒。試劑：牛肉膏、蛋白腖、氯化鈉、磷酸氫二鉀、瓊脂條、0.1mol/L和1mol/L氫氧化鈉、0.1mol/L和1mol/L的鹽酸溶液、蒸餾水等。
四、相關知識點
一、配製原則和種類
（一）培養基配製原則
1、培養基：培養基是提供食用菌等生物生長發育所需的營養與特定環境條件的基質，如蘑菇菌是有機營養型中的草腐生菌。製備培養基不僅要考慮它所需要的含碳化合物、含氮化合物、礦物鹽類、生長因子，還要考慮水與pH環境，同時還應考慮它們培養方式是固體培養還是液體培養。因此，可以把按菌類生長發育需要比例配製的滅菌營養基質，稱為培養基。換言之，培養基必須具備三個條件：含有菌株生長發育所需要的營養物質；具有菌類生長環境條件；經過滅菌，並保持無菌狀態。
2、培養基的選擇：在整菌種製備過程中，從母種到原種、栽培種，各個階段的目的要求有所不同，所選用的培養基的配比也應有所區別。一般母種初生菌絲較嫩弱，分解養分能力差，要求營養豐富、完全，氮源、維生素的比例應高。須選用易於被菌絲吸收利用的物質，如葡萄糖、蔗糖、馬鈴薯、蛋白腖、無機鹽類及生長素等為等而原種、栽培種所需數量較多，且菌絲分解能力強，可利用大量農作物秸稈、糞草、棉籽殼、麩皮、米糠等原料作為培養基。
（二）培養基的種類
1、根據營養物質的來源，可以把培養基分炎天然培養基、半合成培養基和合成培養基。
（1）天然培養基 天然培養基是指用化學成分還不清楚或化學成分不恒定天然有機物配製而成的培養基，如各種農副產品及其下腳料──小麥、大豆、玉米粉、麩皮、米糠、作物秸稈、木屑、棉籽殼、甘蔗渣等，以及動植物組織的浸出液──牛肉膏、肉湯、馬鈴薯汁、麥芽汁、豆芽汁等都可以用來配製天然培養基，這種培養基來源廣，成本低，營養豐富，適合於在生產上大規模培養菌類使用，但這些天然有機物質因產地、品種、生長期的不同，化學成分不能宣。每批成分也不穩定，不宜用來做精細的科學實驗。以分離馴化食用菌培養基
（2）半合成培養基 為了促進食用菌菌絲的生長發育，常在天然培養基中添加適量的無機鹽類，或在合成培養基中添加適量的某些天然有機物，就成為半合成培養基。這類培養基種類繁多，應用廣泛，也是生長菌種和實際栽培最常用的培養基。
（3）合成培養基 是指采用化學成分已知的有機物（碳水化合物、含氮化合物、有機酸類）或無機物配製而成的培養基。這類培養基組成和含量明確，價格較貴，一般用於在實驗室範圍內做有關營養、代謝、菌種鑒定等有關於食用菌的生理生化研究。
2、根據培養基製成後的物理狀態，可將培養基分為液體培養基、半固體培養基和固體培養基。
（1）液體培養基 根據食用菌所需的營養物質，掃一定比例配成營養液，叫液體培養基。液體培養基可進行營養源的篩選實驗，以及生理生化方麵如酶活力等研究，應用液體培養基生產的菌種也可在生產中進行使用。
（2）固化培養基 將各種營養成份按比例配製成營養液後，加入適量固化劑，如瓊脂，即可配成固化培養基。利用這種斜麵試管可保藏及擴大菌種，同時亦可製成各種平皿固化培養基分離菌種。
（3）固體培養基 利用各種富含纖維素和木質素的農林廢棄物如木屑、棉籽殼、秸稈、玉米蕊等作為主要原料，再加入適量的米糠或麩皮和無機鹽類製成固體培養基。該培養基可作為二、三、級菌種生產用的培養基，也可以用它製成發酵草粉保藏菌種用的培養基。
五、實驗步驟
（一）製備牛肉膏蛋白腖瓊脂培養基
1、配方：牛肉膏3—5g、蛋白腖10g、氯化鈉5g、瓊脂20—30g、蒸餾水1000mL。PH值7.4—7.6。
2、步驟：
（1）稱量：根據用量按比例依次稱取各種成分，牛肉膏常用玻璃棒挑取，放在小燒杯或表麵皿中稱量，用熱水融化後到入燒杯，蛋白腖易吸濕，稱量時要迅速。
（2）溶解：在燒杯中加入少於所需的水量，加熱，逐一加入各成分，使其溶解，瓊脂在溶液煮沸後加入，融化過程需不斷攪拌。加熱時應注意火力，勿使培養基燒焦或溢出。溶好後，補足所需水分。
（3）調pH值：若PH值不適宜，可用1mol/L NaOH或1mol/LHCl把pH值調至所需範圍。
（4）過濾：趁熱用濾紙或多層紗布過濾，以利於某些實驗結果的觀察，如無特殊要求時可省去此步驟。
（5）分裝：按照實驗要求，可將配製的培養基分裝入試管內或三角瓶內，分裝時注意，勿使培養基沾染在容器口上，以免沾汙棉塞引起汙染。
液體分裝：分裝高度以試管高度的1/4左右為宜，分裝三角瓶的量則根據需要而定，一般以不超過三角瓶容積的1/2為宜。
‚固體分裝：分裝試管時其裝入量不超過試管高度的1/5，滅菌後製成斜麵，斜麵長度不超過管長的1/2。分裝三角瓶，以不超過容積的1/2為宜。
ƒ半固體分裝：裝入量以試管高度的1/3為宜，滅菌後垂直待凝。
（6）加棉塞：分裝完畢後，在試管口或三角瓶口塞上棉花，以阻止外界微生物進入培養基而造成汙染，並保證有良好的通氣性能。
（7）包紮：棉塞上包一層牛皮紙，紮緊，即可進行滅菌。
（8）滅菌：將上述培養基以0.1Mpa，121℃，高壓蒸汽滅菌20min。
（9）擱置斜麵：將滅菌的試管培養基管口端擱在玻璃棒或其他合適高度的器具上，擱置的斜麵長度以不超過試管總長度的一半為宜。
（10）無菌檢驗：滅菌後的培養基放入37℃恒溫箱中培養24h，以檢驗滅菌效果，無汙染方可使用。
（二）製備馬鈴薯蔗糖瓊脂培養基
1、配方：馬鈴薯（去皮）200g、蔗糖15—20g、瓊脂20—30g、蒸餾水1000mL。PH自然。
2、步驟：
（1）將馬鈴薯洗淨，去皮，切成大小約為1㎝3的小塊，稱200g，放入1000mL水中煮沸20—30分鍾，用雙層沙布過濾，取其液濾。
（2）定容：加水補足至1000mL。
（3）加入蔗糖至全部溶化。
（4）加瓊脂.至全部溶化。
（5）趁熱分裝試管及三角瓶。
（6）加棉塞：分裝完畢後，在試管口或三角瓶口塞上棉花，以阻止外界微生物進入培養基而造成汙染，並保證有良好的通氣性能。
（7）包紮：棉塞上包一層牛皮紙，紮緊，即可進行滅菌。
（8）滅菌：將上述培養基以0.1Mpa，121℃，高壓蒸汽滅菌20min。
（9）擱置斜麵：將滅菌的試管培養基管口端擱在玻璃棒或其他合適高度的器具上，擱置的斜麵長度以不超過試管總長度的一半為宜。
（10）無菌檢驗：滅菌後的培養基放入28℃恒溫箱中培養24h，以檢驗滅菌效果，無汙染方可使用。
注：第（8）（9）（10）步需在實驗二進行。
六、實驗報告要求
1、根據實驗要求，在實驗時間內到實驗室進行實驗時，一邊測量，一邊記錄實驗數據。報告要求準確、美觀。
2、 在實驗中，如果發生實驗測量數據與事先的計算數值不符，甚至相差過大，此時應該找出原因，不能不了了之。同時要把通過實驗所測量的數據與計算值加以比較，如果誤差一般5％以下。
3、在報告的最後要完成指導書上要求解答的思考題。
七、思考題
1、寫出製備牛肉膏蛋白腖瓊脂培養基、馬鈴薯蔗糖瓊脂培養基的步驟。
2、說明製備培養基應注意哪些問題？
上一篇：核酸雜交法檢測病原微生物
下一篇：土壤微生物接種技術
