直接培養法
原理：
直接培養支原體於培養基中，觀察其生長及菌落生成。
特點：
是目前最直接與靈敏之步驟，亦是用來評估其它偵測新步驟之標準步驟。
缺點：
培養時間長，須3－5星期才能判斷。有些支原體不能在培養基培養出來 (例如M. hyorhinis)。需同時培養支原體株作為正反應對照組，可能會造成汙染。
材枓：dextrose、L-arginine HCl、Difco PPLO broth (Difco 0554-17-1) horse serum、15% yeast extract solution (autoclaved)、Bacto agar、無菌有蓋螺旋試管(autoclaved)、無菌培養皿﹙60x15mm﹚、L-玻棒、37℃培養箱、厭氧缸（厭氧缸長期培養易有汙染，所以厭氧包應用無菌水，每次打開厭氧缸後，用70% ethanol擦拭內壁。）
培養基製備：
基本配方為Difco PPLO broth(60%), 馬血清(20%), 15% yeast extreat solution (10%), 10x stock solution (10%)。由於培養時間長，可加入penicillin(50u/ml)至10x stock solution或加入thallium acetate (1：2000)至培養基中以防止其它細菌汙染。
10x stock solution (1 liter) ：稱取50 g dextrose，10 g L-arginine HCl，溶於1 liter蒸餾水中。以0.22μm無菌過濾膜過濾滅菌。分裝100 ml至瓶中，保存於 -70℃。
液體培養基 (1 liter) ：稱取21 g之Difco PPLO broth，0.02 g phenol red 於600ml蒸餾水中，加熱攪拌溶解之。滅菌121℃，15分鍾。待溫度降低至室溫後，於無菌操作台內加入200ml馬血清，100ml之15% yeast extract solution，及100ml解涷之10x stock solution，混合均勻後，分裝至已滅菌之有蓋螺旋試管中，10ml/管。保存於4℃，期限1個月。
固體培養基 (1 liter )：稱取21 g之Difco PPLO broth，0.02 g phenol red，15g Bacto agar於600ml蒸餾水中，加熱溶解之。滅菌121℃，15分鍾。放在50℃水中浴中，待溫度降低至50℃時，於無菌操作台內加入200ml馬血清，100ml之15% yeast extract solution 及100ml解凍之10x stock solution，混合均勻後，倒入60x50㎜之無菌培養皿中，5ml/培養皿。保存於4℃，期限1個月。
步驟：
取1 ml細胞培養液或0.2ml細胞懸浮液，接種於液體培養基中，置於37℃培養二周，觀察是否有混濁或是pH值改變之情形。培養一周及二周後，分別取0.1 ml液體培養液塗在agar plate上，將其倒放置於37℃厭氧箱培養，培養至少3星期，持續觀察是否有支原體之菌落出現。
另取1 ml細胞培養液或0.2ml細胞懸浮液，塗抹在agar plate上，37℃厭氧培養3星期，持續觀察是否支原體菌落出現。
另作正負反應對照組，正反應對照組為Acholeplasma laidlawii (ATCC 23206) 與M. arginini (ATCC 23838)。負反應對照組為待測細胞之新鮮培養基。
結果判讀：
支原體生長較慢，所以先在液體培養基培養1~2周增殖後，再培養於agar plate上。需至少培養3星期後，才可斷定是否有支原體汙染。所以整個測試需5個星期才知正確結果。
典型之支原體菌落類似荷包蛋(fried- egg like)，乃是由於支原體往agar下層生長所致，為圓形無色透明菌落，大小約10-55μm。但是並非所有的支原體皆為似荷包蛋菌落，有些是圓形菌落或是類似粘菌類形態（slime）。
若要區分細胞或是氣泡造成的類似菌落，可將其自agar plate上切下，重新培養於液體培養基中，培養一星期後再種入agar plate，若是細胞則不會生長。
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