病毒蝕斑技術（1）

 

1952年，Dulbecco把噬菌體空斑技術應用於動物病毒學，從而使病毒蝕斑技術 (Virus plaque formation)成為許多病毒的滴定和研究方法。

 

(一) 原理　病毒感染細胞後，由於固體介質的限製，釋放的病毒隻能由最初感染的細胞向周邊擴展。經過幾個增殖周期，便形成一個局限性病變細胞區，此即病毒蝕斑。從理論上講，一個蝕斑是由最初感染細胞的一個病毒顆粒形成的，因而該項技術常用於病毒顆粒計數和分離病毒克隆。但在實際操作中，常出現幾個病毒顆粒同時感染一個細胞的情況，影響滴定的準確性和克隆的純一性，為此，接種的病毒液要充分分散和稀釋。對於細胞結合性病毒，如MDV，需用單層細胞；對細胞釋放性病毒，即可用固相介質懸浮的細胞，也可用單層細胞，但後者需用瓊脂等固體介質蓋在細胞上，以防釋放的病毒在液體介質中流動。固體介質的濃度由病毒的大小而定，大病毒用濃度較低的介質，小病毒用濃度較高的介質，以便將蝕斑的生長速度控製在適宜的範圍內。小蝕斑需用顯微鏡觀察，1-10mm的大蝕斑可用肉眼計數。為便於肉眼觀察，常用中性紅等染料染色。因病變細胞不吸收中性紅，病變細胞區便呈現無色蝕斑。病毒懸液的滴度以每毫升蝕斑形成單位(PFU/ml)來表示。例如，3個細胞瓶的平均蝕斑是58，接種量為0.2ml，病毒的稀釋度為2.5×10³ ，則病毒原液的滴度為：

 

58÷0.2×2.5×10³ ＝7.25×10⁵ (PFU/ml)

 

(二) 技術應用　蝕斑技術可以應用於分離病毒的克隆(無性繁殖純係)、病毒或血清的滴定，也可用蝕斑形態和大小研究病毒的生物學特性。

 

1.病毒生物學純化 (Virus biological purification)　在進行血清中和試驗時,常常會出現標準病毒株的滴度下降，因而影響了試驗的準確性,這種情況多見於蟲煤病毒。這可能是由於原始毒種的混雜,或者已有許多變異病毒粒子存在其中,甚至出現數量眾多的缺陷病毒所致。這時, 有必要把手上掌握的標準毒株進行純化,應用病毒蝕斑技術,挑選出各個不同的純化病毒, 亦稱“克隆株”。克隆後的病毒經在敏感細胞上增殖,測定其滴度,選用合適的毒株用於血清中和試驗。為了更有效地進行純化, 必須在覆蓋營養瓊脂之前用營養液洗去單層細胞上未被吸附的病毒。同時要控製好稀釋的濃度,一個培養瓶中的蝕斑數目最好不超過10個，挑取在其附近10mm都是健康細胞的蝕斑。挑取後的病毒應傳兩代或兩代以上。一般認為，中性紅染料會由於“光敏”作用而抑製病毒蝕斑的形成和破壞宿主細胞。因此，加了中性紅覆蓋層的培養物應在暗處培養。

 

2.蝕斑減少中和試驗(Plaque Reduction Neutralization Test)　蝕斑減少中和試驗是檢測血清中和抗體的一種敏感性較高的方法，試驗以使蝕斑數減少 50％的血清稀釋度作為其中的效價。 試驗使用定量的病毒(100PFU)與不同稀釋度的等量血清混合後感作, 接種預先準備好的單層細胞,再覆蓋上營養瓊脂置37 ℃二氧化碳培養箱培養,數天後分別統計蝕斑數,用Karber法計算該血清的蝕斑中和效價。其操作原理與傳統的血清中和試驗大致相同。

 

由於本試驗的操作比較繁鎖，目前在國內極少應用,國際上也沒有把它作為一種各國都接受的診斷方法，僅在OIE國際動物衛生法典(第六版)中列為對裂穀熱的規定診斷方法之一。