植物病原真菌的分離培養

 

一、實驗原理

 

植物患病組織內的真菌菌絲體，如果給予適宜的環境條件，除個別種類外，一般都能恢複生長和繁殖。植物病原菌的分離就是指通過人工培養，從染病植物組織中將病原真菌與其它雜菌相分開，並從寄主植物中分離出來，再將分離到的病原菌於適宜環境內純化，這個過程總稱植物病菌的分離培養。植物病原真菌的分離一般都是采用組織分離法，就是切取小塊病組織，經表麵消毒和滅菌水洗過後，移到人工培養基上培養。

 

二、實驗目的

 

植物病原菌的分離培養是植物病理學實驗最基本的操作技術之一，它對原害鑒定，病原形態觀察、植物病害接種體的培養等方麵都是經常使用的研究手段。通過本實驗，要求植物病原菌分離培養的一般原則和方法。

 

三、實驗材料及準備

 

1．分離材料：梨黑斑病（Alternaria kikuchiana），柿樹圓斑病（Pestnlotia sp）及杉木炭疽病（Glomerella cingolata）新發病的病葉；楊樹爛皮病（Cytospora chrysosperma）國槐腐爛病（Dothiorella sp.）的帶有新病斑的枝條；油鬆種子。

 

2．分離用具（每小組為單位）

 

酒精燈4個，手術剪4把，眼科鑷4把，PDA培養基3瓶，培養皿（Φ9cm）24套，小燒杯（5ml）4個，大燒杯1個，斜麵培養基12管，滅菌水4瓶，75%酒精瓶1個（內放脫脂棉球）0.1%升汞瓶1個，5%乳酸瓶（60ml）1個，火柴1盒，濕、幹紗布各4張。

 

四、實驗方法及步驟

 

（一）分離前的準備工作

 

1．工作環境的清潔和消毒

 

分離培養一般在無菌室、無菌箱或無菌工作台（超淨工作台）上進行，無菌室和無菌箱要經過噴霧除塵，並用藥物或紫外線照射消毒（常用消毒藥物為70%酒精，2%煤酚皂液，5%石炭酸液等噴霧。若用紫外線燈照射則需20-30分鍾）。在沒有上述設備條件時，在清潔房間裏關閉門窗，避免空氣流動，經過噴霧除去空氣及地麵灰塵後進行操作，也可獲得較好的結果。工作前擦淨桌麵，最好鋪上濕紗布。將所需用的物品按次序放在工作台上，避免工作時走動，工作人員最好穿上滅菌後的工作服，帶上口罩，並用肥皂洗手，用70%酒精或0.1%新潔爾滅擦手。

 

2．分離用具的消毒

 

凡是和分離材料接觸的器皿（刀、剪、鑷、針等）都要隨時（至少在使用時）保持無菌，將這些用具浸於70%酒精中，使用時在燈焰上滅菌燒去酒精，如此2-3次（刀、剪、鑷等不宜在燈焰上燒時過長，以防退火）。再次使用時必須重複滅菌。培養皿、試驗等要經過幹熱滅菌。培養基及洗滌或稀釋用蒸餾水都需要事先經過高壓蒸氣滅菌。

 

3．分離材料的選擇

 

用新發病的植株、器官或組織做為分離材料，可以減少腐生菌的汙染。任何植物壞死部分的內部或表麵，都可能有腐生微生物的孽生，所以一般斑點病害應從鄰近健全組織，即從病、健組織交界處獲得分離材料。

（二）植物病原菌的分離

 

1．葉斑類和枝杆病斑類（非維管束侵染）病原菌分離

 

首先選擇具有典型症狀的新鮮病葉作為分離材料，按下述步驟操作：

 

①培養基平板製備：將PDA培養基在微波爐中加熱熔化驗，以無菌操作法將溶化過的培養基傾注入滅過菌的培養基中，每皿經12毫升，可形成2-3毫米厚的平板。（為防止細菌汙染，倒碟前給每三角瓶內加6%乳酸4-6滴）。

 

②病葉或病枝經自來水衝洗，從病斑周轉1-2毫米處的健組織部位剪下（若為枝幹，則將帶有病斑的皮層剝下，但）。

 

③取10毫升小燒杯經酒帶消毒，放入分離材料，倒入0.1%升汞液適量作表麵消毒一分鍾，或用1%漂白粉消毒均可。

 

④消毒後傾出消毒液，用無菌水衝洗2——3，最後一次無菌水不要倒掉。

 

⑤用滅菌鑷，剪在無菌水中將分離材料剪成2——3毫米大小的方塊，每塊組織均應為病健相間組織。用滅菌鑷子夾取剪好的材料，放入培養基平板上，輕輕按壓。每皿4——5塊，排放均勻。

 

⑥用蠟筆在培養皿上注明分離代號，日期、姓名，將培養皿翻轉放置於23—25℃

 

⑦3-4日後挑選由分離材料上長出的典型而無雜菌的菌落，在菌落邊緣用移菌針挑取帶有菌絲的培養基一小塊，轉入試管斜麵培養基中央，於25℃溫箱中培養。

 

2．種子內病菌的分離

 

將整粒種子或種子的一部分進行衝洗，再經表麵消毒（升汞或漂白粉），最後用滅菌水洗滌後移到人工培養基平板上培養（或者直接放在皿內保濕培養於25℃溫箱中）。

 

3．危害輸導組織病原的分離（以枯萎病為代表）

 

先將分離莖作表麵消毒，然後用滅菌刀剝去表皮，剪取其中小塊變色的維管束組織，再用漂白粉進行表現消毒後，移於培養基平麵上培養。

 

4．分離物的純化

 

前述方法獲得分離物，必須經過純化，才能成為培養，純化的方法有單孢子分離法和邊續稀釋培養法兩種，後者簡便，為了一般研究所常用。

 

連續稀釋法：對真菌材料來說，就是從典型菌落邊緣切取含有菌絲的培養基一小塊，移植於另一培養基平板上，待菌落形成後，再依此法移植。如此數次，直至菌落形態典型，無雜菌時即可移入斜麵試管中培養保存。

附：

 

1、0.1%升汞液的配製：升汞1克，濃鹽酸2.5毫升；加水1000毫升。注意要先將升汞用鹽酸溶解，然後加水稀釋。

 

2、P.D.A培養基成分；馬鈴薯200克，葡萄糖10-20克，洋菜17-20克，水1000毫升。

 

3、水洋菜培養基成分，洋菜17-20克，水1000毫升。