微生物發酵培養基的優化方法（1）

 

     對於微生物的生長及發酵，其培養基成份非常複雜，特別是有關微生物發酵的培養基，各營養物質和生長因子之間的配比，以及它們之間的相互作用是非常微妙的。麵對特定的微生物，人們希望找到一種最適合其生長及發酵的培養基，在原來的基礎上提高發酵產物的產量，以期達到生產最大發酵產物的目的。發酵培養基的優化在微生物產業化生產中舉足輕重，是從實驗室到工業生產的必要環節。能否設計出一個好的發酵培養基，是一個發酵產品工業化成功中非常重要的一步[2]。以工業微生物為例，選育或構建一株優良菌株僅僅是一個開始，要使優良菌株的潛力充分發揮出來，還必須優化其發酵過程，以獲得較高的產物濃度（便於下遊處理），較高的底物轉化率（降低原料成本）和較高的生產強度（縮短發酵周期）[7]。設計發酵培養基時還應時刻把工業應用的目的留在腦海裏[22]。

1 發酵培養基的成分

     現代分離的微生物絕大部分是異養型微生物，它需要碳水化合物、蛋白質和前體等物質提供能量和構成特定產物的需要[2]。其營養物質一般包括碳源、氮源（有機氮源、無機氮源）、無機鹽及微量元素、生長因子、前體、產物促進和抑製劑等。另外，在設計培養基時還必須把經濟問題和原材料的供應問題等因素一起考慮在內[6]。

     此外，還要考慮所篩選的菌種來源的地點環境，比如本實驗室長期從事紅樹林微生物的分離及其研究工作，紅樹林的環境處於海洋與陸地之間，所以配製培養基所用的水除了一般的去離子水外還包括陳海水。

    如果在知道產物結構或者產物合成途徑的情況下，我們可以有意識地加入構成產物和合成途徑中所需的特定結構物質。我們也可以結合某一菌株的特定代謝途徑，加入阻遏或者促進物質，使目的產物過量合成。例如青黴素的合成會受到賴氨酸的強烈抑製，而賴氨酸合成的前體α-氨基已二酸可以緩解賴氨酸的抑製作用，並能刺激賴氨酸的合成。這是因為α-氨基已二酸是合成青黴素和賴氨酸的共同前體。如果賴氨酸過量，它就會抑製這個反應途徑中的第一個酶，減少α-氨基已二酸的產量，從而進一步影響青黴素的合成。

２ 發酵培養基的設計和優化

    由於發酵培養基成份眾多，且各因素常存在交互作用，很難建立理論模型；另外，由於測量數據常包含較大的誤差，也影響了培養基優化過程的準確評估，因此培養基優化工作的量大且複雜[8]。許多實驗技術和方法都在發酵培養基優化上得到應用，如：生物模型（Biologicalmimicry）、單次試驗（One at a time）、全因子法（Full factorial）、部分因子法（Partialfactorial）、Plackett andBurman法等。但每一種實驗設計都有它的優點和缺點，不可能隻用一種試驗設計來完成所有的工作[22]。

2.1 單次單因子法

    實驗室最常用的優化方法是單次單因子(one-variable-at-a-time)法，這種方法是在假設因素間不存在交互作用的前提下，通過一次改變一個因素的水平而其他因素保持恒定水平，然後逐個因素進行考察的優化方法。但是由於考察的因素間經常存在交互作用，使得該方法並非總能獲得最佳的優化條件。另外，當考察的因素較多時，需要太多的實驗次數和較長的實驗周期[3]。所以現在的培養基優化實驗中一般不采用或不單獨采用這種方法，而采用多因子試驗。

2.2 多因子試驗

多因子試驗需要解決的兩個問題1)哪些因子對響應具有最大(或最小)的效應，哪些因子間具有交互作用。(2)感興趣區域的因子組合情況，並對獨立變量進行優化[8]。

2.2.1 正交實驗設計

正交實驗設計是安排多因子的一種常用方法，通過合理的實驗設計，可用少量的具有代表性的試驗來代替全麵試驗，較快地取得實驗結果。正交實驗的實質就是選擇適當的正交表，合理安排實驗的分析實驗結果的一種實驗方法。具體可以分為下麵四步：（1）根據問題的要求和客觀的條件確定因子和水平，列出因子水平表；（2）根據因子和水平數選用合適的正交表，設計正交表頭，並安排實驗；（3）根據正交表給出的實驗方案，進行實驗；（4）對實驗結果進行分析，選出較優的“試驗”條件以及對結果有顯著影響的因子[2]。

正交試驗設計注重如何科學合理地安排試驗，可同時考慮幾種因素，尋找最佳因素水平結合，但它不能在給出的整個區域上找到因素和響應值之間的一個明確的函數表達式即回歸方程，從而無法找到整個區域上因素的最佳組合和響應麵值的最優值[4]。

正交方法可以用來分析因素之間的交叉效應，但需要提前考慮那些因素之間存在交互作用，再根據考慮來設計實驗。因此，沒有預先考慮的兩因素之間即使存在交互作用，在結果中也得不到顯示。

對於多因素、多水平的科學試驗來說，正交法需要進行的次數仍嫌太多，在實際工作中常常無法安排，應用範圍受到限製[20]。

2.2.2 均勻實驗設計

如果僅考慮“均勻分散”，而不考慮“整齊可比”，完全從“均勻分散”的角度出發的實驗設計，叫做均勻設計。均勻設計按均勻設計表來安排實驗，均勻設計表在使用時最值得注意的是均勻設計表中各列的因素水平不能像正交表那樣任意改變次序，而隻能按照原來的次序進行平滑，即把原來的最後一個水平與第一個水平銜接起來，組成一個封閉圈，然後從任一處開始定為第一個水平，按圈的原方向和相反方向依次排出第二、第三水平[9,13]。均勻設計隻考慮試驗點在試驗範圍內均勻分布，因而可使所需試驗次數大大減少。例如一項５因素10水平的試驗，若用正交設計需要做102次試驗，而用均勻設計隻需做10次，隨著水平數的增多，均勻設計的優越性就愈加突出。這就大大減少了多因素多水平試驗中的試驗次數[19]。

2.2.3 Plackett-Burman法

Plackett-Bunnan設計法是一種兩水平的實驗優化方法[22]，它試圖用最少的實驗次數達到使因子的主效果得到盡可能精確的估計，適用於從眾多的考察因子中快速有效地篩選出最為重要的幾個因子，供進一步優化研究用。理論上Plackett-Bunnan設計法可以達到99個因子僅做100次試驗，但該法不能考察各因子的相互交互作用[22]。因此，它通常作為過程優化的初步實驗，用於確定影響過程的重要因子[14]。許多文獻都對此有報道[28]。Castro PML報道用此法設計20種培養基，做24次試驗，把gamma幹擾素（gammainterferon）的產量提高了45%[23]。

2.2.4 部分因子設計法

部分因子設計法與P1ackett-Burman設計法一樣是一種兩水平的實驗優化方法，能夠用比全因子實驗次數少得多的實驗，從大量影響因子中篩選出重要的因子。根據實驗數據擬合出一次多項式，並以此利用最陡爬坡法確定最大響應區域，以便利用響應麵法進一步優化。部分因子設計法與Plaekett-Burman設計法相比實驗次數稍多，如6因子的26-2部分因子設法需要進行20次實驗，而Plackett-Burman設計法隻需要7次實驗[14]。

2.2.5 響應麵分析法

響應麵分析（response surfaceanalysis，RSM）方法是數學與統計學相結合的產物，和其他統計方法一樣，由於采用了合理的實驗設計，能以最經濟的方式，用很少的實驗數量和時間對實驗進行全麵研究，科學地提供局部與整體的關係，從而取得明確的、有目的的結論。它與“正交設計法”不同，響應麵分析方法以回歸方法作為函數估算的工具，將多因子實驗中，因子與實驗結果的相互關係，用多項式近似，把因子與實驗結果（響應值）的關係函數化，依此可對函數的麵進行分析，研究因子與響應值之間，因子與因子之間的相互關係，並進行優化[2]。近年來較多的報道都是用響應麵分析法來優化發酵培養基，並取得比較好的成果[24,25,26,27]。

RSM有許多方麵的優點，但它仍有一定的局限性。首先，如果將因素水平選的太寬，或選的關鍵因素不全，將會導致響應麵出現吊兜和鞍點。因此事先必須進行調研，查詢和充分的論證或者通過其它試驗設計得出主要影響因子；其次，通過回歸分析得到的結果隻能對該類實驗作估計；第三，當回歸數據用於預測時，隻能在因素所限的範圍內進行預測[4]。響應麵擬合方程隻在考察的緊接鄰域裏才充分近似真實情形，在其他區域，擬合方程與被近似的函數方程毫無相似之處，幾乎無意義[15]。

中心組合設計是一種國際上較為常用的響應麵法，是一種5水平的實驗設計法。采用該法能夠在有限的實驗次數下，對影響生物過程的因子及其交互作用進行評價，而且還能對各因子進行優化，以獲得影響過程的最佳條件[14,18]。