慢病毒（Lentivirus）

 

慢病毒（Lentivirus）載體是以HIV-1（人類免疫缺陷I型病毒）為基礎發展起來的基因治療載體。區別一般的逆轉錄病毒載體，它對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力。慢病毒載體的研究發展得很快，研究的也非常深入。該載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達到持久性表達。在感染能力方麵可有效地感染神經元細胞、肝細胞、心肌細胞、腫瘤細胞、內皮細胞、幹細胞等多種類型的細胞，從而達到良好的的基因治療效果，在美國已經開展了臨床研究，效果非常理想，因此具有廣闊的應用前景。

 

    目前慢病毒也被廣泛地應用於表達RNAi的研究中。由於有些類型細胞脂質體轉染效果差，轉移到細胞內的siRNA半衰期短，體外合成siRNA對基因表達的抑製作用通常是短暫的，因而使其應用受到較大的限製。采用事先在體外構建能夠表達siRNA的載體, 然後轉移到細胞內轉錄siRNA的策略，不但使脂質體有效轉染的細胞種類增加，而且對基因表達抑製效果也不遜色於體外合成siRNA，在長期穩定表達載體的細胞中，甚至可以發揮長期阻斷基因表達的作用。在所構建的siRNA表達載體中，是由RNA聚合酶Ⅲ啟動子來指導RNA合成的，這是因為RNA聚合酶Ⅲ 有明確的起始和終止序列，而且合成的RNA不會帶poly A尾。當RNA聚合酶Ⅲ遇到連續4個或5個T時，它指導的轉錄就會停止，在轉錄產物3’端形成1~4個U。U6和H1 RNA啟動子是兩種RNA聚合酶Ⅲ依賴的啟動子，其特點是啟動子自身元素均位於轉錄區的上遊，適合於表達～21ntRNA和～50ntRNA莖環結構（stem loop）。在siRNA表達載體中，構成siRNA的正義與反義鏈，可由各自的啟動子分別轉錄,然後兩條鏈互補結合形成siRNA；也可由載體直接表達小發卡狀RNA(small hairpin RNA, shRNA), 載體包含位於RNA聚合酶Ⅲ啟動子和4～5Ｔ轉錄終止位點之間的莖環結構序列，轉錄後即可折疊成具有1~4 個U  3 ’ 突出端的莖環結構，在細胞內進一步加工成siRNA。構建載體前通常要通過合成siRNA的方法，尋找高效的siRNA，然後從中挑選符合載體要求的序列，將其引入siRNA表達載體。

 

    慢病毒載體（Lentiviral vector）較逆轉錄病毒載體有更廣的宿主範圍，慢病毒能夠有效感染非周期性和有絲分裂後的細胞。慢病毒載體能夠產生表達shRNA的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性細胞、幹細胞、受精卵以及分化的後代細胞中表達shRNA，實現在多種類型的細胞和轉基因小鼠中特異而穩定的基因表達的功能性沉默，為在原代的人和動物細胞組織中快速而高效地研究基因功能，以及產生特定基因表達降低的動物提供了可能性。慢病毒作為siRNA的攜帶者，不但具備特異性地使基因表達沉默的能力，而且充分發揮了慢病毒載體自身所具備的優勢，為基因功能的研究提供了更強有力的工具。

 

慢病毒表達載體包含了包裝、轉染、穩定整合所需要的遺傳信息。慢病毒包裝質粒可提供所有的轉錄並包裝RNA 到重組的假病毒載體所需要的所有輔助蛋白。為產生高滴度的病毒顆粒，需要利用表達載體和包裝質粒同時共轉染細胞，在細胞中進行病毒的包裝，包裝好的假病毒顆粒分泌到細胞外的培養基中，離心取得上清液後，可以直接用於宿主細胞的感染，目的基因進入到宿主細胞之後，經過反轉錄，整合到基因組，從而高水平的表達效應分子。