大腸杆菌質粒的抽提

苯酚/氯仿溶液抽提法

1. 接種5ml LB，37℃搖床過夜培養（12小時）

2. 離心，3000rpm，5min去上清

3. 振蕩混勻沉澱，分裝在2個離心管中，spin一下，吸去上清，加入150μl的溶液I （50mmol/L葡萄糖,  25mmol/L  Tris•Cl(PH8.0),  10mmol/L EDTA(PH8.0) 在10lbf/in2（6.895×104Pa）高壓蒸氣下滅菌15min（8磅），貯存於4℃），劇烈振蕩5分鍾打散菌體（菌體不打散容易在產物中出現較多蛋白）。

4. 加入300μl溶液II（0.2mol/LnaOH, 1%SDS, 用2倍的溶液現配現用）後立即振蕩混合均勻，處理2分鍾後加入225μl溶液III（5mol/L乙酸鉀 60ml，冰乙酸 11.5ml，水 28.5ml）混合均勻，12000rpm離心5min，取上清液中於新的離心管。

5. 加120μl酸性苯酚/氯仿溶液，振蕩混勻，12000rpm離心5min，再取上清液中於新的離心管中。

6. 用120ul氯仿重複操作5。

7. 加等體積的異丙醇或2倍體積的乙醇，混勻，12000rpm離心7min。

8. 沉澱用70%乙醇洗滌兩次,每次10min。50℃烘幹後加適量無菌去離子水（ddH2O）溶解，-20℃保存。

 

 

氯化鋰抽提法

1. 前四部同苯酚/氯仿溶液抽提法（用Solution I II III處理）

2. 加等體積的異丙醇，混勻，沉澱DNA，12000rpm離心7min。去上清，盡量去幹淨。

3.用少量70％乙醇洗一下（洗去異丙醇），離心去盡酒精，50℃烘幹沉澱，用適量ddH2O（100ul）充分溶解（可在50度水浴中助溶）後加入4/5體積的氯化鋰溶液（濃度約10mol/L）處理1min沉澱RNA和蛋白。

4.12000rpm離心5min，取上清液於新的離心管中，用等體積的異丙醇混勻，12000rpm離心8min，去上清。

5. 將沉澱用70%乙醇洗滌兩次,每次10min。50℃烘幹後加一定量的無菌去離子水（ddH2O）溶解，-20℃保存。

 

酶連反應

一般采用10μl反應體係：

T4連接酶 1μl ，連接酶緩衝液1μl ，外源片段與載體按DNA 摩爾含量3:1加入即可。

如果是粘端連接，則需把外源片段和載體的混合物在50度處理10分鍾使粘端變性，然後立即放入冰中5分鍾。

平端連接采用14度，粘端連接采用16度，連接4小時以上（一般可過夜）。

＊外源片段與載體按DNA 摩爾含量為3:1或外源更多。