微生物檢驗染色技術（1）

 

 

由於微生物細胞含有大量水分（一般在80-90%以上），對光線的吸收和反射與水溶液的差別不大，與周圍背景沒有明顯的明暗差。所以，除了觀察活體微生物細胞的運動性和直接計算菌數外，絕大多數情況下都必須經過染色後，才能在顯微鏡下進行觀察。但是，任何一項技術都不是完美無缺的。染色後的微生物標本是死的，在染色過程中微生物的形態與結構均會發生一些變化，不能完全代表其生活細胞的真實情況，染色觀察時必須注意。

 

　　本節包括四部分：

　　一、染色的基本原理

　　二、染料的種類和選擇

　　三、製片和染色的基本程序 

　　四、染色方法 

 

一、染色的基本原理

 

　　微生物染色的基本原理，是借助物理因素和化學因素的作用而進行的。物理因素如細胞及細胞物質對染料的毛細現象、滲透、吸附作用等。化學因素則是根據細胞物質和染料的不同性質而發生地各種化學反應。酸性物質對於堿性染料較易吸附，且吸附作用穩固；同樣，堿性物質對酸性染料較易於吸附。如酸性物質細胞核對於堿性染料就有化學親和力，易於吸附。但是，要使酸性物質染上酸性材料，必須把它們的物理形式加以改變（如改變pH值），才利於吸附作用的發生。相反，堿性物質（如細胞質）通常僅能染上酸性染料，若把它們變為適宜的物理形式，也同樣能與堿性染料發生吸附作用。

　　細菌的等電點較低，pH值大約在2—5之間，故在中性、堿性或弱酸性溶液中，菌體蛋白質電離後帶陰電荷；而堿性染料電離時染料離子帶陽電。因此，帶陰電的細菌常和帶陽電的堿性染料進行結合。所以，在細菌學上常用堿性染料進行染色。

 

　　影響染色的其它因素，還有菌體細胞的構造和其外膜的通透性，如細胞膜的通透性、膜孔的大小和細胞結構完整與否，在染色上都起一定作用。此外，培養基的組成、菌令、染色液中的電介質含量和pH、溫度、藥物的作用等，也都能影響細菌的染色。

 

二、染料的種類和選擇

 

　　染料分為天然染料和人工染料兩種。天然染料有胭脂蟲紅、地衣素、石蕊和蘇木素等，它們多從植物體中提取得到，其成分複雜，有些至今還未搞清楚。目前主要采用人工染料，也稱煤焦油染料，多從煤焦油中提取獲得，是苯的衍生物。多數染料為帶色的有機酸或堿類，難溶於水，而易溶於有機溶劑中。為使它們易溶於水，通常製成鹽類。

 

 

　　染料可按其電離後染料離子所帶電荷的性質，分為酸性染料、堿性染料、中性（複合）染料和單純染料四大類。

 

1、酸性染料

 

　　這類染料電離後染料離子帶負電，如伊紅、剛果紅、藻紅、苯胺黑、苦味酸和酸性複紅等，可與堿性物質結合成鹽。當培養基因糖類分解產酸使pH值下降時，細菌所帶的正電荷增加，這時選擇酸性染料，易被染色。

 

2、堿性染料

 

　　這類染料電離後染料離子帶正電，可與酸性物質結合成鹽。微生物實驗室一般常用的堿性染料有美蘭、甲基紫、結晶紫、堿性複紅、中性紅、孔雀綠和蕃紅等，在一般的情況下，細菌易被堿性染料染色。

 

3、中性（複合）染料

 

　　酸性染料與堿性染料的結合物叫做中性（複合）染料，如瑞脫氏（Wright）染料和基姆薩氏（Gimsa）染料等，後者常用於細胞核的染色。

 

4、單純染料

 

　　這類染料的化學親和力低，不能和被染的物質生成鹽，其染色能力視其是否溶於被染物而定，因為它們大多數都屬於偶氮化合物，不溶於水，但溶於脂肪溶劑中，如紫丹類（Sudanb）的染料。