細菌耐藥性檢測方法

 

 

1、細菌耐藥表型檢測：判斷細菌對抗菌藥物的耐藥性可根據NCCLS標準，通過測量紙片擴散法、肉湯稀釋法和E試驗的抑菌圈直徑、MIC值和IC值獲得。也可通過以下方法進行檢測：

（1）耐藥篩選試驗：以單一藥物的單一濃度檢測細菌的耐藥性被稱為耐藥篩選試驗，臨床上常用於篩選耐甲氧西林葡萄球菌、萬古黴素中介的葡萄球菌、耐萬古黴素腸球菌及氨基糖苷類高水平耐藥的腸球菌等。

（2）折點敏感試驗：僅用特定的抗菌藥物濃度（敏感、中介或耐藥折點MIC），而不使用測定MIC時所用的係列對倍稀釋抗生素濃度測試細菌對抗菌藥物的敏感性，稱為折點敏感試驗。

（3）雙紙片協同試驗：雙紙片協同試驗是主要用於篩選產超廣譜β-內酰胺酶（ESBLs）革蘭陰性杆菌的紙片瓊脂擴散試驗。若指示藥敏紙片在朝向阿莫西林/克拉維酸方向有抑菌圈擴大現象（協同），說明測試菌產生超廣譜β-內酰胺酶

（4）藥敏試驗的儀器化和自動化：全自動細菌鑒定及藥敏分析儀如：Vitek-2、BD-Pheonix、Microscan等運用折點敏感試驗的原理可半定量測定抗菌藥物的MIC值。

 

2．β-內酰胺酶檢測：主要有碘澱粉測定法（iodometric test）和頭孢硝噻吩紙片法（nitrocefin test）。臨床常用頭孢硝噻吩紙片法，β-內酰胺酶試驗可快速檢測流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌、卡他莫拉菌和腸球菌對青黴素的耐藥性。如β-內酰胺酶陽性，表示上述細菌對青黴素、氨苄西林、阿莫西林耐藥；表示葡萄球菌和腸球菌對青黴素（包括氨基、羧基和脲基青黴素）耐藥。

 

3．耐藥基因檢測：臨床可檢測的耐藥基因主要有：葡萄球菌與甲氧西林耐藥有關的MecA基因,大腸埃希菌與β-內酰胺類耐藥有關的blaTEM、blaSHV、blaOXA基因，腸球菌與萬古黴素耐藥有關的vanA、vanB、vanC、vanD基因。檢測抗菌藥物耐藥基因的方法主要有：

PCR擴增、PCR-RFLP分析、PCR-SSCP 分析、PCR-線性探針分析、生物芯片技術 、自動DNA測序

 

 4．特殊耐藥菌檢測

（1）耐甲氧西林葡萄球菌檢測：對 1цg苯唑西林紙片的抑菌圈直徑≤10㎜，或其MIC≥4цg/ml的金黃色葡萄球菌和對1цg苯唑西林紙片的抑菌圈直徑≤17㎜，或MIC≥0.5цg/ml的凝固酶陰性葡萄球菌被稱為耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）。對MRS不論其體外藥敏試驗結果，所有的β-內酰胺類藥物和β-內酰胺/β-內酰胺酶抑製劑均顯示臨床無效；絕大多數的MRS常為多重耐藥，耐藥範圍包括氨基糖甙類、大環內酯類、四環素類等。

（2）耐青黴素肺炎鏈球菌檢測：當對1цg苯唑西林紙片抑菌圈直徑〈20㎜或MIC〉0.06цg/ml均應視為耐青黴素肺炎鏈球菌（PRSP）。臨床治療顯示 PRSP對氨卞西林、氨卞西林/舒巴坦、頭胞克肟、頭胞唑肟，臨床治療療效很差，但應檢測對頭胞曲鬆、頭胞噻肟和美洛培南等的MIC以判斷是否對這些抗生素敏感。

（3）耐萬古黴素腸球菌檢測：腸球菌對30цg萬古黴素紙片抑菌圈直徑≤14㎜或MIC≥32цg/ml被稱為耐萬古黴素腸球菌（VRE）。針對多重萬古黴素藥物目前尚無有效治療方法，但對青黴素敏感的VRE可用青黴素和慶大黴素聯合治療，若對青黴素耐藥而不是高水平耐氨基糖甙類可用壁黴素+慶大黴素。

（4）產超廣譜β-內酰胺酶的腸杆菌科細菌檢測： 超廣譜β-內酰胺酶是一種能水解青黴素、廣譜頭孢菌素及單胺類的酶，主要由克雷伯菌、腸杆菌等細菌產生。當通過篩選法時對頭孢泊肟、頭孢他啶（10цg/片）抑菌圈≤22㎜或氨曲南、頭孢噻肟（30цg/片）≤27㎜的菌株經頭孢他啶（30цg/片）、頭孢他啶/克拉維酸（30/10цg）；頭孢噻肟（30цg/片）、頭孢噻肟/克拉維酸（30/10цg）兩組表型確證試驗，其結果為兩組中任何一組藥物加克拉維酸與不加克拉維酸的抑菌圈相比，增大值≥5㎜時判斷為產ESBL菌株（圖7-13）。產ESBL克雷伯菌和大腸埃希菌不論其體外藥物敏感試驗結果如何，對青黴素、頭孢菌素和氨曲南治療無效。