微生物及無菌知識——消毒與滅菌

消毒與滅菌

 

消毒與滅菌是微生物實驗技術中最基本的操作，從事藥品生產和檢驗的人員都應當了解消毒與滅菌的方法及其意義，嚴格遵守操作規程，否則會影響產品質量，危害患者安全。

1．概念

Ø無菌——不存在活的生物（GMP指南）。

“無菌”從定義上來說是一個絕對的概念，但遺憾的是，在科學和技術高度發展的今天，藥品的絕對無菌即做不到，也無法加以證實。然而，無菌製劑的安全性要求人們設定無菌的相對標準。

FDA、歐洲製藥工業界曾將百萬分之一微生物汙染率作為滅菌產品“無菌”的相對標準，它和蒸汽滅菌後產品中微生物存活的概率為10^-6（即產品的無菌保證值為6），係同一標準的不同表示法。這一標準於1980起收錄於USP XX中，如今已為世界各國普遍接受和采用。

Ø滅菌——使達到無菌狀態的方法（GMP指南）。用物理或化學方法殺滅傳播媒介上所有的微生物，使其達到無菌（GB）。通常是指殺滅或除去全部活的微生物（包括繁殖體和芽孢）。

Ø消毒——用物理或化學方法殺滅或清除傳播媒介上的病原微生物，使其達到無害化（GB）。通常是指殺死病原微生物的繁殖體，但不能破壞其芽孢。所以消毒是不徹底的，不能代替滅菌。

Ø無菌製劑——不存在活的微生物的製劑（GMP指南）。

Ø非無菌製劑——所含活的微生物量符合衛生學標準的製劑（GMP指南）。

2．常用消毒劑

 

3．常用滅菌法

1）幹熱滅菌法　常見的有火焰、燒灼、幹烤和紅外線滅菌等。

①火焰、燒灼：通常用於實驗室無菌操作中金屬或其它耐火材料製成的器具的滅菌。

②幹烤和紅外線：利用幹熱空氣或熱輻射進行滅菌。一般135~145℃需3~5h，160~170℃需2h以上，170~180℃需1h以上，180~200℃需0.5~1h。除熱原則需250℃30min，或200℃45min，180℃2h。

空氣傳熱慢，穿透力不強，故幹熱滅菌時間長。幹熱滅菌時烤箱內裝入物品應留有空隙，以利空氣流動，否則使箱內溫度不均，部分物品滅菌不徹底。

2）濕熱滅菌法　通過熱蒸汽或沸水使蛋白質變性而殺滅微生物的方法。濕熱穿透力強，滅菌效果較幹熱好。

①煮沸或流通蒸汽滅菌：常壓下沸水和蒸汽的溫度是100℃，一般處理30~60min可殺死細菌繁殖體，但不能完全殺滅芽孢。此法適用於不能高壓蒸汽滅菌的物品。

②低溫間隙滅菌（巴斯德滅菌法）：將物品先用60~80℃加熱（或煮沸）1h，然後置20~25℃保存24h（或常溫過夜），使其中殘存的芽孢萌發成繁殖體，再用以上條件滅菌，如此反複三次。本法適用於不耐高溫或高溫下易變質的物品，但很費時。

③高壓蒸汽滅菌（熱壓滅菌法）：超過一個大氣壓時，水的沸點高於100℃，反之亦然。高壓蒸汽滅菌就是通過加壓提高蒸汽溫度，滅菌效果最好。它簡便、經濟、可靠、無毒，是最可靠、應用最廣泛的滅菌法。此法適用於耐高溫和潮濕的物品。常用條件為：

115.5℃         30min

121.5℃         20min

126.5℃         15min

注意事項：

a. 必須完全排出滅菌器內的空氣。否則會影響滅菌器內溫度達到規定的要求。

b. 注意被滅菌物品的溫度。滅菌器內溫度與被滅菌物品的溫度一般是一致的，但在蒸汽輸入過快時，後者可能低於前者，所以升溫時要有一定的預熱時間。另外，降溫過快易引起玻璃炸裂。因此，對於一種滅菌產品，應製定一固定的滅菌曲線（象凍幹曲線一樣）。

c. 定期檢查滅菌器內溫度的準確性。

3）化學滅菌法　利用化學試劑形成的氣體來殺滅微生物的方法。常用的滅菌劑為環氧乙烷（又稱氧化乙烯）。環氧乙烷是廣譜殺菌劑，能殺滅細菌、芽孢和多種病毒，還能殺死昆蟲及蟲卵。但由於環氧乙烷易燃易爆且有毒（有致變異性），用於藥品方麵極有限，多用於醫療器械、塑料製品等滅菌。（不能用於橡膠和乳膠手套，能將其溶解。）

4）濾過除菌法　利用細菌不能通過致密具孔濾材的原理，除去對熱不穩定的藥品溶液或液體物質中的細菌的方法。過濾法一般隻能除菌，不能除去支原體和病毒。

過濾除菌的效果與濾膜的性能、孔徑的大小、密度、濾膜的厚度等因素有關。

濾過除菌法要求最終過濾的濾膜孔徑為0.22μm。由於各廠家生產的相同規格的濾膜質量並不一致，為了保證除菌效果，在使用前後應檢查濾器的完好性（如壓力維持試驗或起泡點試驗）。

一個過濾器的使用時間應根據品種驗證後確定，一般不應超過8小時。

5）輻射滅菌法　輻射有兩種類型：一種是電磁波輻射，如紫外線、紅外線、微波；一種是電離輻射，如可引起被照射物電離的X射線、γ射線。

①紫外線：紫外光波長在136~390nm之間，其中260nm左右能破壞核酸，殺菌作用最強。另外，空氣中的氧受紫外線照射後，可微量轉變為臭氧共同起殺菌作用。紫外線消毒的效果與光源的功率、光源與被照射物的距離、照射時間、溫度和濕度等因素有關。我國規定紫外燈照射強度在距離1m處不低於70μW/cm²（以紫外線測強儀測定）。在操作麵上要求強度達40μW/cm²以上。一般每10m²裝30W燈管1支，工作前開30~60min。

紫外燈的輸出功率隨使用時間增加而降低。國產紫外燈的平均壽命（點到70%額定功率的時間）一般為2000h，超過平均壽命時，就達不到預期效果，必須更換。

紫外線的穿透力很弱，不能穿透一般包裝材料，如玻璃、塑料薄膜、紙等。玻璃能強烈吸收小於350nm的紫外線，石英玻璃能吸收小於200nm的紫外線。因此，它主要用於空氣和物體表麵消毒，特製的紫外燈裝置也可用於水的消毒。

紫外線對眼、皮膚有損壞，照射過程中產生的臭氧對眼、鼻腔有刺激，臭氧過多時使人頭暈、胸悶、血壓下降。

②紅外線：通過加熱碳化矽板產生的輻射熱能，由空氣傳導加熱滅菌。如紅外線烤箱，溫度可達180℃左右。熱效應特點是由表及裏。

③微波：微波滅菌主要是因其熱效應。微波加熱升溫快，溫度高且均勻，殺菌作用強。熱效應特點是由裏及表。不同性質的物品吸收微波的能力不同，其熱效應和消毒效果也不同。

微波有一定穿透力，但不強。微波對人體有害，要注意防護。

④⁶⁰Co滅菌：放射性同位素⁶⁰Co（或¹³⁷Cs）衰變時可放射出γ射線，γ射線的能量高、穿透力強，可使細胞內各種活性物質發生化學變化，從而使細菌損傷或死亡。

經⁶⁰Co輻射滅菌的物品溫度升高很少，一般僅約5℃，故又稱“冷滅菌”。

⁶⁰Co輻射存在兩個方麵的安全問題：一是輻射的直接作用。γ射線對人體細胞同樣有害；二是經過輻射的食品、藥品的安全性。1984年美國農業部食品安全實驗室用輻射處理的雞肉喂飼小鼠，發現患睾丸腫瘤增加，包括加重癌病損害。因此⁶⁰Co輻射用於食品和藥品都應經過安全試驗，進行科學的、全麵的評價，高劑量的輻射藥品更應慎重。

美國藥典規定25kGy為有效滅菌劑量。1997年我國衛生部頒發了⁶⁰Co中藥滅菌標準，該標準限國內流通中藥可用⁶⁰Co輻照滅菌，規定了允許輻照的藥材和中成藥的品種和劑量。

中藥輻照最大吸收劑量標準：

散劑          3kGy

片劑          3kGy

丸劑          5kGy

中藥原料粉    6kGy