單核細胞增生李斯特菌及其檢驗

單核細胞增生李斯特菌及其檢驗
 Listeria monocytogenes

一、概述

單核細胞增生李斯特菌 (L. monocytogenes)歸屬於李斯特菌屬(Listeria)。單核細胞增生李斯特菌是李斯特菌屬中唯一對人致病的病菌。

    李斯特菌是一種細胞內寄生菌，它不僅可能存在於肉類產品中，也可能存在於乳製品、蔬菜、沙拉及海產品等日常食物裏麵。此菌廣泛分布於自然界中，在土壤、排汙下水、地表水、青貯飼料、爛菜中均可分離到。人也可作為無症狀攜帶者。據報道，健康人糞便中該菌的攜帶率為0.6％～16％，4％～8％的水產品、5％～10％的奶及其製品、30％以上的肉製品及15％以上的家禽均被該菌汙染。李斯特菌能在1～45℃的溫度下生存，能在家用電冰箱的冷藏室內較長時間生長、繁殖。

    人感染的主要來源是食用被該菌汙染的食品，主要通過糞-口途徑傳播。自然感染的傳播途徑包括消化道、呼吸道、眼結膜以及皮膚損傷。本菌主要引起致死性的腦膜炎和膿毒症，孕婦流產和新生兒細菌性腦炎。此菌的致病力強，尤其是免疫缺陷病人感染後，病死率可高達30%～70%。近幾年來，李斯特菌病已呈世界性分布，北美和西歐等許多國家人食源性李斯特菌病日漸增多，且引起多起病人的死亡。因此，食品中存在的單核細胞增生性李斯特氏菌對人類的安全具有危險，如今已有20多個國家把它列為“食品致病菌”。

二、生物學特性

(一)形態與染色特性

該菌為革蘭氏陽性短杆菌，有的菌體略彎曲，兩端鈍圓，大小約為0.4～0.5µm ´ 0.5～2.0µm。多單在，有時是V字型排列。  無芽孢，不產生莢膜。在陳舊培養物中或粗糙型菌落的菌體長度可達6～20µm或更長的絲狀。在20～25℃培養時可產生2～4根鞭毛而運動，但在37℃培養時鞭毛發育不良，無運動性。

(二)培養特性

本菌需氧或兼性厭氧，生長溫度為1～45℃，最適溫度為30～37℃。對營養要求不高，可在普通瓊脂培養基中生長，但在血瓊脂培養基或胰酪胴瓊脂上生長更好。加入0.2％～1％(W/V)的葡萄糖及2％～3％(V/V)的甘油生長更佳。在含1%(W/V)NaCl的複合培養基中能生長。在4℃可緩慢增殖，形成菌落約需7d。

在液體培養基中培養18～24h後，肉湯呈輕度均勻混濁，數天後形成粘稠沉澱附著於管底，搖動時沉澱呈螺旋狀，繼續培養可形成顆粒狀沉澱。不形成菌環、菌膜。

在營養瓊脂上，光滑(S)型可形成直徑0.5～1.5mm、圓形、露滴狀半透明、低隆起、邊緣整齊、表麵有細致紋理的藍灰色菌落，斜射光照射時，菌落呈特征性藍綠光澤。R型菌落表麵起伏不平，邊緣不整齊，細菌難以乳化。

在血液瓊脂培養基上，可形成狹窄的β-溶血環，常不超出菌落邊緣，移去菌落才可見。弱溶血或疑似溶血菌株可用協同溶血試驗(CAMP)鑒定。

半固體培養基：沿穿刺線呈雲霧狀，隨後緩慢擴散，在培養基表麵下3～5mm處呈傘狀。

(三)生化特性

該菌接觸酶陽性，氧化酶陰性。能發酵多種糖類，產酸不產氣，如發酵葡萄糖、果糖、海藻糖、乳糖、鼠李糖、麥芽糖、山梨糖，不發酵木糖、阿拉伯糖、棉子糖、蔗糖、甘露醇、蜜二糖、菊糖、纖維二糖和側金盞花醇。不利用枸櫞酸鹽。不還原硝酸鹽，不產生靛基質和硫化氫。甲基紅及VP試驗呈陽性。不液化明膠和凝固血清。可水解七葉苷和馬尿酸鈉。

(四)抵抗力

該菌對理化因素抵抗力較強，在土壤、糞便、青貯飼料和幹草內能長期存活。對堿和鹽的抵抗力強。常規的巴氏消毒法不能殺滅它，60～70℃經30 min才能殺死此菌。該菌體外試驗對青毒素、氨苄青黴素、四環素均敏感，對土黴素敏感性差，對磺胺、枯草杆菌素和多粘菌素有抵抗力。

Listeria monocytogenes is a Gram-positive rod-shaped bacterium. It is the agent of listeriosis, a serious infection caused by eating food contaminated with the bacteria.

The disease affects primarily pregnant women, newborns, and adults with weakened immune systems.

Listeriosis is a serious disease for humans; the overt form of the disease has a mortality greater than 25 percent. The two main clinical manifestations are sepsis and meningitis. Meningitis is often complicated by encephalitis, a pathology that is unusual for bacterial infections.

This normal inhabitant of the gastrointestinal tract and of animal feces led to a 1986 outbreak in Massachusetts hospital patients.

Oxoid Limited has launched a new chromogenic medium for the improved isolation, enumeration and identification of Listeria from food samples.  In addition to providing presumptive identification of Listeria species, Oxoid Chromogenic Listeria Agar ( OCLA ) Plate (PO5165A) is also able to differentiate pathogenic Listeria monocytogenes and Listeria ivanovii from other Listeria species.

 

三、檢驗

常規細菌學檢驗   檢驗規程見GB/T 4789.30－2003

1. 塗片鏡檢    用生理鹽水製成菌懸液，在油鏡或相差顯微鏡下觀察，該菌出現輕微旋轉或翻滾樣的運動。

2. 增菌培養    EB增菌液30±1℃培養48h～7d。LB1增菌液培養24h，取出0.1mL，加入10mL LB2增菌液中二次增菌。

3. 分離培養    將EB增菌液和LB2二次增菌液劃線於選擇培養基瓊脂平板上，30±1℃48h，挑選可疑菌落，用白熾燈斜光照射平板，李斯特氏菌的菌落為灰藍或藍色、小的圓形菌落。

選5個以上的上述可疑菌落接種三糖鐵(TSI)瓊脂和EIM動力培養基，培養於25±1℃，觀察是否有動力，及成傘狀或月芽狀生長。一般觀察2～7d，陽性者可做下一步鑒定。將上述有動力、形成傘狀者並在三糖鐵瓊脂培養基上層、下層產酸而不產硫化氫的可疑培養物接種於胰酪腖大豆瓊脂培養基(TSA-YE)上，做純培養供做以下鑒定。

4. 細菌鑒定

(1)對小鼠的致病力試驗：取0.5mL濃縮菌液注射小白鼠腹腔，接種3～5隻，觀察小鼠死亡情況。致病株2～5d 內死亡。單核細胞增生李斯特氏菌對小鼠有致病性，在肝和脾可見到局部壞死，並能從髒器和心血中分離出細菌。

(2)協同溶血試驗(CAMP)：在血平板上平行接種金黃色葡萄球菌和馬紅球菌(R.equi)，在它們中間垂直接種可疑李斯特氏菌，但不要觸及，30℃培養24～48h，檢查平板中垂直接種點對溶血環的影響。靠近金黃色葡萄球菌接種點的單核細胞增生李斯特菌的溶血增強，西爾李斯特氏菌的溶血也增強，而綿羊李斯特氏菌在馬紅球菌附近的溶血增強，有助於鑒別。

5. 結果報告    根據病料塗片鏡檢結果可作出初步判斷；依據細菌分離培養和細菌鑒定的各項試驗結果，可作出從檢樣中檢出單核細胞增生李斯特菌的報告。