乳粉中阪崎腸杆菌的檢測方法（2）

阪崎腸杆菌在EMB瓊脂平板上呈紫紅色粘液狀，菌落較大，相鄰菌落之間易於融合。 在Mac—conKev脂平板上大小約2～3 mm, 呈淡粉色。在SorbitolMacConKey瓊脂平板上 不發酵山梨醇．形成中等大小、圓形突起、邊緣整齊的淡黃色菌落。

選擇在sorbitolMacConKey瓊脂平板上挑取單個菌落接種TSA斜麵． 阪崎腸杆菌在 36℃+1℃條件下培養18-24 h．能形成較明顯的色素。

2．2．1 形態與染色

革蘭氏染色鏡檢為G- 無芽孢短杆菌．呈球杆狀或成對排列．有時亦可呈短鏈狀。

2．2．2  生化特性

菌株觸酶陽性、氧化酶陰性、動力陽性、葡萄糖代謝類型 (0／F)為發酵型( F )，IMViC： 靛基質陰性、MR陰性、vP陽性、檸檬酸鹽陽性，在TSA斜麵上產黃色色素，做進一步進行生化鑒定，結果如表1所示。   

 

本次實驗室分離2株阪崎腸杆菌。菌株0819 -041生化反應與標準菌株有不同之處：①衛矛醇陽性。阪崎腸杆菌此項生化反應陽性的僅占0—9％的機率^［4］。②苦可仁甙陰性．此項生化反應是陽性．此項結果陰性目前還未見報道。③明膠酶陽性，明膠酶是胞外蛋白酶的一種．大部分細菌則沒有這種能力一般梭狀菌、芽孢杆菌、變形杆菌、 假單胞菌具有胞外蛋白酶．使明膠分解而失去凝固力．阪崎腸杆菌明膠酶陽性機率很少。④乳糖為遲緩發酵 (72h )，陰溝腸杆菌會出現乳糖遲緩發酵現象．分析此現象與朱永紅報道的阪崎腸杆菌與陰 溝腸杆菌有31％-49％DNA 序列同源^［3］性有關。 菌株0819 - -041經北京藥品生物製品檢定所依據《伯傑細菌鑒定手冊》第9版對其進行鑒定，確認阪崎腸杆菌。

兩種修複培養及培養基靈敏度比較結果如表2所示

 

 

表2中，在溫 度 為 36℃ ±1℃ 條 件 下 培 養 時 間 均 為 18 ～24  h。 

取2～8℃冰箱保 個月的阪崎腸杆菌斜麵直接製備菌懸液。觀察修複培養生長情況，試 驗結果表明：分別取0．1ml塗布普通營養瓊脂平板，經36℃±1℃培養18-24h．未生長阪崎腸杆菌。經修複培養及腸道增菌培養後．A和B兩組均能在5種分離培養基上生長，B組比A組修複培養靈敏度高出1個稀釋度(10倍)。

2．4 生物學特征及生長情況

阪崎腸杆菌在5種分離培養基上生物學特征及生長情況比較結果如表3所示 

 

 注：+為陽性；-為陰性。

 

用2％NutirentAgar與5種腸道分離培養基比較．Sorbitol Mac ConKey，MacConKey，Xa—GicA培養基上菌落生長數量基本相接近<10％。無統計學差異。Xa—GicA上菌落呈藍綠色，選擇性強，但菌落生長較小。在 MB和VRB—GA瓊脂平板上阪崎腸杆菌都呈紫紅色黏液 狀．由於有融合生長情況．菌落數量有明顯差異。

3．1菌株分離要點

選擇分離培養基最好選用弱選擇性和強選擇性培養基各1種或鑒別培養基進行分離養．增 加分離平板種類以及從分離平板上挑選多個可疑菌落進行鑒定。阪崎腸杆菌為腸杆菌科、腸 杆菌屬革蘭氏陰性無芽孢短杆菌。因此，選擇了3種常用的腸道分離培養基．凡是腸杆菌科 的細菌都能在此平板上生長。EMB和MacConKey分別為弱選擇性及選擇性分離培養基，S or—bitol Mac Con Key可作為鑒別培養基．因為阪崎腸杆菌有不分解山梨醇的特性。挑取菌落要選擇在SorbitolMacConKe上淡黃色或無色的菌落，在MacConKey瓊脂平板上呈淡粉色。阪崎腸杆菌EMB瓊脂平板上呈紫紅色黏液狀，不易在此平板上挑取單個菌落，隻作為 輔助觀察。在Sorbitol MacConKey挑取的單個菌落連續接種4支 TSA斜麵，便於觀察黃色 色素以及分別用於做氧化酶、觸酶、生化鑒定及G染色，留1支存放置2～8℃ 冰箱保存。這樣保證了所做的生化鑒定與保存的菌種來自於同1個菌落。  

美國疾病預防控製中心2002年從商業配方乳粉中分離到阪崎腸杆菌。當時使用基於Muytjens的方法：100g配方乳粉與400 mL，45℃磷緩衝蛋白腖水(BPW) 混合，36℃培養過 夜^［3］。本文采用這一步驟作為修複培養來提高檢測靈敏度。因為乳粉在生產過程中要經過高溫噴霧幹燥，致病菌易受到亞致死性損傷。比較結果表明：A和B兩組對嬰幼兒乳粉中阪崎腸杆菌均能起到修複的作用．B組修複培養靈敏度比A組高出1個稀釋度(10倍)。阪崎腸杆菌在5種分離培養基上都能生長，其菌落顏色及特征符合該菌的生物學特征性反應。

3．3價格的比較

阪崎腸杆菌分離培養基使用價格的比較結果如表4所示 。     

3．4 出廠檢驗中的應用比較

熒光PCR試劑盒1900．0元( 48支／盒)：PCR試劑盒1800．0元(48支／盒)。API 20 E為1050．0元 (25支／套)，定性檢測，每件樣品做1管．分離培養僅挑取1個菌落鑒定計算，結果如表5所示 。

 

 

如果平均每天抽5批次，每批次樣品做1管，僅挑取1個菌落鑒定來計算．4 種方法1年所需金額比較結果如表6所示。 

 

注：*為使用Xa-GiaA分離培養基。

    鑒於目前國內外對阪崎腸杆菌檢測並無限定標準（標準值≤），國家規定嬰兒配方乳粉中是不得檢出阪崎腸杆菌。因此本文參照SN/T1632.1-2005中標準進行定性檢測。傳統微生 物培養具有鑒定結果可靠的特點．能將阪崎腸杆菌鑒定至種．VRBGA 分離培養基鑒定結 果

需要7～8d．使用XaGiaA 分離培養基鑒定結果需要5～6d。選擇EMB．MacConKey，Sorb itolMacConKey這3種常用腸道分離培養基，且檢測費用低廉，方法便捷，檢測鑒定過程6d， 不需更多的設備．隻需1台36℃±1℃恒溫培養箱．便於乳品企業對每批次產品進行阪崎腸

杆菌檢測．有效降低了企業及檢測機構檢測阪崎腸杆菌的成本。為執法部門的監管帶來更多的便利．有著巨大的社會效益和經濟效益。

PCR方法及熒光PCR方法可以快速有效地檢測目的基因，快速篩選。但是篩選陽性還必須經傳統微生物培養、生化鑒定，且檢測成本很高．企業檢驗人員操作有一定的難度。PCR和熒光PCR方法在分子生物學上特異性高．能在種的水平上進一步鑒別菌株間同種不同型的差異，對阪崎腸杆菌各分離株之間進行DNA序列同源性比較．有更大的意義。

作者：高建新，盧兆芸， 肖菊珍， 吳越

作者單位：南 昌 市 疾 病 預 防 控 製 中 心

 

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