病毒基礎知識（3）

（四）分子病毒學的研究時期
　　自從1953年DNA雙螺旋結構理論建立以來，由於分子生物學的迅速發展，新技術和新方法的應用，使得病毒學的研究步入了分子病毒學的發展時期。50年代至60年代是分子生物學的奠基時代，而病毒特別是噬菌體和植物病毒為此做出了巨大的貢獻,因此分子病毒學也正是分子生物學的發展過程中應運而生。分子病毒學的發展是各相關學科如分子生物學、細胞生物學、遺傳學、免疫學與病毒學理論和技術相互滲透的結果。尤其是分子生物學新技術的發明極大剌激了分子病毒學的發展。分子病毒學的發展經曆了如下過程：
　　1953年，Watson和Crick建立了DNA雙螺旋結構理論，它使人們開始從分子水平上去認識遺傳物質--DNA的結構基礎和複製特性，理解基因表達與性狀的關係，從而為分子生物學和分子病毒學的創立奠定了基礎。
　　1962年，D.L.D.Casfar闡明了許多病毒的二十麵體結構，明確了病毒核衣殼二十麵體的構成規律，這是對病毒超微結構認識的重大突破。
　　1962年，D.Nathans成功地進行了噬菌體RNA的體外翻譯；1965年，S.Spiegelman成功地在體外複製出Qβ噬菌體RNA；1967年M.Goulian成功地體外複製ΦX174噬菌體。這些工作對以後闡明DNA病毒和RNA病毒 的繁殖機製起了重要作用。
　　1967年，T.O.Diener發現了類病毒，他在試圖分離馬鈴薯紡錘形塊莖病的病毒時，發現其病原不是病毒，而是一種不含有蛋白質，分子量為105左右的裸露RNA。這樣小的RNA分子不編碼任何蛋白質。根據其特殊的性質，Diener把這類致病因子稱為“類病毒（Viroids）”。隨後的研究表明，類病毒RNA還有特殊的複製機製。類病毒的發現在分子病毒學史上是一個重要事件，它不僅揭示了自然界存在著比病毒更簡單的生物，而且也使人們加深了對生命起源的認識。在類病毒報道之後，有人在澳大利亞又發現了類似於類病毒的環狀RNA分子還能與病毒基因組RNA共同包被於RNA病毒粒子中，引起絨毛菸、苜菪和地三葉草產生病害，其中類似於類病毒的RNA稱為“擬病毒（virusoid）”。羊瘙癢病(scrapie)最初也認為是類病毒引起的，Prusiner於1982年證實瘙癢因子不是類病毒，而是一種分子量隻有3.0×104的蛋白質，稱為“蛋白侵染因子”或“朊病毒”（prion）。根據類病毒的發現，Lavoff（1981）首先提出把病毒分為真病毒（envirus）和類病毒的概念。隨著擬病毒和朊病毒的相繼發現，1983年在意大利召開的“植物和動物的亞病毒病原：類病毒和朊病毒”國際學術討論會上，把類病毒、擬病毒和朊病毒列入亞病毒（subvirus）。
　　1968年，P.H.Duesberg發現流感病毒的多節段RNA基因組，隨後在其他一些病毒中如呼腸孤病毒、大麥條紋花葉病毒中也發現了病毒基因組分節現象的存在。
　　1970年，P.H.Duelerg發現Rous肉瘤病毒含有癌基因v-src，而且在正常雞以及其他脊椎動物和無脊椎動物的DNA中，也發現有癌基因v-src的同源序列存在，推測病毒癌基因是來自於細胞正常基因。隨著其他腫瘤病毒致癌基因的發現，腫瘤病毒的細胞培養係統建立，以及腫瘤病毒對細胞轉化誘導作用的確定，使人們對腫瘤發生的機製有了更深刻的了解。
1970年，H.M.Temin和D.Baltimor分別發現了病毒的逆轉錄酶。逆轉錄酶基因組RNA在逆轉錄酶的作用下，首先合成原病毒DNA，然後原病毒可整合到宿主染色體DNA上。除了病毒癌基因外，原病毒在宿主DNA上的插入、整合，也可以引起細胞癌基因的激活和細胞轉化，逆轉錄酶和逆轉錄過程的發現，是對Crick 1958年提出的遺傳學中心法則的重要補充和發展，說明遺傳信息不僅可以從DNA RNA，也可由RNA DNA。
　　1971年，限製性內切酶技術的發現為DNA序列分析和病毒基因的定位創造了條件，利用這一技術曾經成功地為乳頭瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、皰疹病毒構建了酶切圖譜。另一些新技術如基因轉移方法、Southen blot的相繼誕生，也加快了病毒特異性基因，尤其是轉化基因的定位和病毒核酸序列分析的進程。除此以外，70年代出現的DNA重組技術，使一些病毒基因組能在原核細胞的質粒載體上克隆，並在細菌中能夠得到大量複製和表達產物，因而有利於探尋病毒的基因組結構和功能。
　　1977年，英國劍橋大學的Sanger完成了ΦX174-DNA全部序列的測定,為此Sanger第二次獲得諾貝爾獎。根據ΦX174-DNA全部序列的分析結果，Sanger意想不到地發現了基因重疊現象。隨後，在DNA噬菌體如R17、MS2、F2、Qβ中也證實了基因重疊現象的存在，這是病毒利用有限的遺傳信息執行更多的功能，提高自身在進化過程中適應能力的一種表現。
　　1977年，L．T．Chow闡明了腺病毒轉錄過程中的mRNA拚接現象，隨後在SV40、多瘤病毒中也相繼發現了mRNA轉錄後的拚接過程，從而證實了真核基因的不連續性，明確了內含子（intron）和外顯子（exon）的概念。
　　1978年，W．Fiers和V.B.Reddy測定了SV40-DNA的一級結構由5224個堿基對組成。SV40是第一個全部核苷酸序列被搞清楚的真核病毒，它含有結構基因VP1、VP2、VP3以及轉化基因T和t，整個基因組有12.5%非編碼區或非翻譯區，在這些區域中包含啟動子、增強子序列和其他調節序列，可對病毒基因組複製、轉錄、翻譯進行調控。由於SV40既是研究真核基因結構和表達的良好模型，又是研究癌變機製的理想材料，因此，SV40-DNA一級結構的測定具有重要意義。
　　在70年代，Miller和Barbara研究ΦX174-DNA轉錄時還發現了ΦX174-DNA僅有一條鏈被轉錄，他們利用ΦX174噬菌體感染大腸杆菌，並在培養基中加入32P-磷酸鹽以製備放射性的噬菌體mRNA，然後再將標記的mRNA分離出來，讓其與分開來的RF-DNA正負鏈雜交，結果觀察到僅有RF-DNA的負鏈與標記mRNA形成雜交體。因而讓實在活體內ΦX174的RF DNA中僅一條鏈是轉錄的模板。與此相類似，T7噬菌體DNA在活體中也隻有一條單鏈被轉錄。但在T4或λ噬菌體中情形較為複雜,其基因組中的某些部分是以一條鏈作為模板，而在另一區域，則是以另一條鏈為模板。大腸杆菌基因組的轉錄也同樣存在一組基因與另一組基因的模板鏈不同。

1979年，T．Taniguchi用載體成功地表達了人幹擾素基因。這是基因工程的一項大突破。進入八十年代後，分子病毒學的研究無論是在深度和廣度都有了很大的發展。這裏隻舉一些重要進展。
　　1981年，D.K.Kleid等利用重組DNA技術製備出口蹄疫病毒疫苗；
　　1982年，J.Summers等發現乙型肝炎病毒DNA複製中有逆轉錄過程；
　　1982年，B.Moss和E.Paoletti用痘苗病毒作為載體表達外源基因；

1983年，Montagnier和R.C.Gallo分別分離到與AIDS相關的人類逆轉錄病毒（HIV）；
　　1985年，H.Vonder Patten等在3A下闡明了鼻病毒的晶體結構;
　　1988年，Chuo和Yamaya用弱病毒全長cDNA導入產生抗病毒的轉化植株；
　　1990年以來，PCR技術在分子病毒學領域得到了廣泛應用，目前PCR已成為病毒性疾病診斷和研究的重要手段。

1993年，美國科學家K.Mullis由於發明了PCR儀而與第一個設計基因定點突變的Smith共享諾貝爾化學獎。
　　1991年，Han等將Moloney鼠白血病毒的反義表達序列導入小鼠受精卵中，從而培育成功對該病毒有抗性的轉基因小鼠。
　　1992年，Desrosiers等利用SIV mac239/nef缺失突變株製備出減毒活疫苗，取得了抗SIV感染成功，也給HIV疫苗的研究賦予了許多啟示。
　　1995年，HIV天冬氨酰蛋白酶三維結構的鑒定，使得一些針對病毒蛋白酶活性位點的抑製劑先後問世。

1996年，David Ho利用逆轉錄酶抑製劑與蛋白酶抑製劑配成的“雞尾酒”式藥，成功地抵抗了HIV感染，因而1996年稱為AIDS希望年。
　　1997年，美國加利福尼亞大學的神經病學和病毒學教授S.Prusiner由於發現了羊瘙癢病的致病因子是朊病毒（prion），以及提出了瘋牛病、Creutz-feldt-Jakob氏病、Kuru病等腦退化性疾病是由朊病毒引起的理論，而獲得了諾貝爾醫學獎。然而朊病毒究竟是一種傳染性因子，還是由正常基因突變形成的結構異常的蛋白質，至今仍處於爭論之中。
　　病毒學經過上述四個時期的發展，逐漸形成和成熟起來，隨著病毒基因組複製、基因表達調控原理、病毒與宿主細胞的相互作用規律，病毒感染和致病的分子機製的揭示，以及分子病毒學在技術上的革新和進步，它將為人類克服和戰勝病毒病做出貢獻。