藥敏試驗操作

實驗步驟

一、實驗材料

 

　　普通營養瓊脂培養基：可去生化試劑店購買，做不同細菌的藥敏試驗可選擇不同的培養基，如做大腸杆菌的藥敏試驗可選擇普通營養瓊脂或麥康凱培養基。做沙門氏菌可選擇血清培養基。

　　藥敏試紙：購買或自製（詳見實驗準備）

　　細菌：待做藥敏試驗的細菌

　　儀器：接種環、酒精燈、打孔器、牛津杯、移液器、滴頭

 

二、實驗準備

 

　　2.1　藥敏片的準備：購買或自製

　　2.1.1　製備方法：取新華1號定性濾紙，用打孔機打成6毫米直徑的圓形小紙片。取圓紙片50片放入清潔幹燥的青黴素空瓶中，瓶口以單層牛皮紙包紮。經15磅15-20分鍾高壓消毒後，放在37℃溫箱或烘箱中數天，使完全幹燥。

　　2.1.2　抗菌藥紙片製作：在上述含有50片紙片的青黴素瓶內加入藥液0.25毫升，並翻動紙片，使各紙片充分浸透藥液，翻動紙片時不能將紙片搗爛。同時在瓶口上記錄藥物名稱，放37℃溫箱內過夜，幹燥後即密蓋，如有條件可真空幹燥。切勿受潮，置陰暗幹燥處存放，有效期3-6個月。

　　2.2　藥液的製備（用於商品藥的試驗）：按商品藥的使用治療量的比例配製藥液；如商品藥百病消按其說明量治療量0.01%飲水，可按這個比例配製藥液，可取10毫克加入10毫升的水中混勻。此稀釋液即為用於做藥敏試驗的藥液。

 

三、實驗操作方法

 

　　3.1　藥敏片法

　　3.1.1　在“超淨台”中，用經（酒精燈）火焰滅菌的接種環挑取適量細菌培養物，以劃線方式將細菌塗布到平皿培養基上。具體方式；用滅菌接種環取適量細菌分別在平皿邊緣相對四點塗菌，以每點開始劃線塗菌至平皿的1/2。然後，找到第二點劃線至平皿的1/2，依次劃線，直至細菌均勻密布於平皿。（另：可挑取待試細菌於少量生理鹽水中製成細菌混懸液，用滅菌棉拭子將待檢細菌混懸液塗布於平皿培養基表麵。要求塗布均勻致密）

　　3.1.2　將鑷子於酒精燈火焰滅菌後略停，取藥敏片貼到平皿培養基表麵。為了使藥敏片與培養基緊密相貼，可用鑷子輕按幾下藥敏片。為了使能準確的觀察結果，要求藥敏片能有規律的分布於平皿培養基上；一般可在平皿中央貼一片，外周可等距離貼若幹片（外周一般可貼七片），每種藥敏片的名稱要記住。

　　3.1.3　將平皿培養基置於37℃溫箱中培養24小時後，觀察效果。

　　3.2　牛津杯法

　　　　3.2.1　在“超淨台”中，用經（酒精燈）火焰滅菌的接種環挑取適量細菌培養物，以劃線方式將細菌塗布到平皿培養基上。具體方式；用滅菌接種環取適量細菌分別在平皿邊緣相對四點塗菌，以每點開始劃線塗菌至平皿的1/2。然後，找到第二點劃線至平皿的1/2，依次劃線，直至細菌均勻密布於平皿。（另：可挑取待試細菌於少量生理鹽水中製成細菌混懸液，用滅菌棉拭子將待檢細菌混懸液塗布於平皿培養基表麵。要求塗布均勻致密。）

　　3.2.2　以無菌操作將滅菌的不鏽鋼小管（內徑6nm、外徑8nm、高10nm的圓形小管，管的兩端要光滑，也可用玻璃管、瓷管），放置在培養基上，輕輕加壓，使其與培養基接觸無空隙，並在小管處標記各種藥物名稱。每個平板可放4-6支小管。待分鍾後，分別向各小管中滴加一定數量的各種藥液，勿使其外溢。置37℃培養8-18小時，觀察結果。

　　3.2.3　將平皿培養基置於37℃溫箱中培養24小時後，觀察效果。

　　3.3　打孔法：

　　該法較簡單，成本低，易操作，比較適用於商品藥物的檢測。

　　3.3.1　在“超淨台”中，用經（酒精燈）火焰滅菌的接種環挑取適量細菌培養物，以劃線方式將細菌塗布到平皿培養基上。具體方式；用滅菌接種環取適量細菌分別在平皿邊緣相對四點塗菌，以每點開始劃線塗菌至平皿的1/2。然後，找到第二點劃線至平皿的1/2，依次劃線，直至細菌均勻密布於平皿。（另：可挑取待試細菌於少量生理鹽水中製成細菌混懸液，用滅菌棉拭子將待檢細菌混懸液塗布於平皿培養基表麵。要求塗布均勻致密。）

　　3.3.2　以無菌操作將滅菌的不鏽鋼小管（外徑為4毫米、孔徑與孔距均為3毫米，管的兩端要光滑，也可用玻璃管、瓷管），放置在培養基上打孔，將孔中的培養基用針頭挑出，並以火焰封底，使培養基能充分的與平皿融合（以防藥液滲漏，影響結果）。

　　3.3.3　加樣：按不同藥液加樣，樣品加至滿而不溢為止。

　　3.3.4　將平皿培養基置於37℃溫箱中培養24小時後，觀察效果。

 

結果觀察

 

　　在塗有細菌的瓊脂平板上，抗菌藥物在瓊脂內向四周擴散，其濃度呈梯度遞減，因此在紙片周圍一定距離內的細菌生長受到抑製。過夜培養後形成一個抑菌圈，抑菌圈越大，說明該菌對此藥敏感性越大，反之越小，若無抑菌圈，則說明該菌對此藥具有耐藥性。其直徑大小與藥物濃度、劃線細菌濃度有直接關係。

 

判定標準

 

　　一、藥敏實驗的結果，應按抑菌圈直徑大小作為判定敏感度高低的標準。

　　表1　藥物敏感實驗判定標準

抑菌圈直徑（毫米） 敏感度

20以上 極敏

15~20 高敏

10~14 中敏

10以下 低敏

0 不敏

 

　　二、藥物敏感實驗判定標準參考表1，多黏菌素抑菌圈；在9毫米以上為高敏，6—9毫米為低敏，無抑菌圈為不敏。