阪崎腸杆菌噬菌體的分離及其生物學特性（1）

摘要： 【目的】以阪崎腸杆菌模式菌株及分離菌株為指示菌，從汙水中分離出該菌噬菌體，並對其基本生物學特性進行研究。【方法】以雙層瓊脂法從汙水中分離噬菌體，通過同屬和同科參考菌株測定噬菌體的特異性和宿主譜；電鏡觀察噬菌體顆粒形態；隨機擴增多態性DNA ( RAPD ) 實驗分析噬菌體的分子生物學特性。【結果】從汙水中分離得到5株噬菌體，表現出較窄的宿主範圍，僅裂解阪崎腸杆菌，以ATCC51329分離的噬菌體SK2可裂婀 17株阪崎腸杆菌中的24株 (89％)，負染經電鏡觀察，5株噬菌體都是由多麵體頭部和尾部組成；隨機引物( 5^’一GAAACGGGTG一3^’ ) 擴增DNA分析，5株噬菌體DNA明顯不同：【結論】分離出的5株噬菌體僅對阪崎腸杆菌敏感，在阪崎腸杆菌的分型、預防、治療、以及生態環境的淨化等方麵具有潛在用途。

關鍵詞：阪崎腸杆菌；噬菌體

中圖分類號：X172   文獻標識碼：A   文章編號：0001—6209(2008)10- 1373-05 

 

近年來，阪崎腸杆菌( Enterobacter sakazakii) 通過嬰幼兒配方奶粉引起新生兒發病、導致死亡而受到廣泛關注…，2002同際食品微生物標準委員會將其定為威脅特殊人群生命或產生嚴重後遺症的食源性病原菌。該菌1984年前被稱為產黃色素的陰溝腸杆菌，之後重新劃分為腸杆菌屬的一個新種^［2］。目前已從工廠加工環境、食品原料及多種食品中分離出阪崎腸杆菌，為此，各國食品安全管理部門、生產嬰幼兒食品的企業對阪崎腸杆菌開始控製，研究人員對其生物學特性、控製方法及溯源性方麗開展研究。作為細菌病毒的噬菌體，以其嚴格的宿主特異性。應用於細菌的分型鑒定，並逐步在應對多重耐藥菌株、醫學治療和預防、食品加工衛生、建立新型畜牧和發酵工廠的消毒程序等方麵開發其應用價值，被認為是未來有效、安全的病原體治療和生態環境淨化生物製劑^［5］。

盡管噬菌體的研究曆史很長，但對於阪崎腸杆菌噬菌體而言，直到2007年才第一次報道，也是目前查到的僅有的一篇文獻^［6］。本文以ATCC標準菌株和分離菌株為指示菌，從汙水中分離得到對阪崎腸杆菌具有特異性的噬菌體，並對噬菌體、噬斑形態、宿主範圍、分子生物學特性等方麵進行了研究。

 

 

1 材料和方法

1．1 材料

1．1．1 菌株：阪崎腸杆菌：ATCC29544，ATCC 29004，ATCC 12868，ATCC 51329；陰溝腸杆菌( Enterobactercloacae ) ATCC 13047，產氣腸杆菌( Enterobacter aero—gene ) ATCC  13048，大腸埃希氏菌( Escherichia coli ) ATCC 11775。弗氏枸櫞酸杆菌( Citrobacter freundii) ATCC 8090，奇異變形杆菌(Proteus mirabilis) ATCC 10005，產酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxyto ca ) ATCC 43165， 肺炎克雷伯氏菌( Klebsiella pneumoniae ) ATCC 4352，來自美國典型菌種

保藏中心 ( American TVpe Culture Collection，ATCC 。 其餘27株阪崎腸杆菌IQCCl0403、IQCC10403． 1—10403． 26為本實驗室收集的從奶粉中分離菌株。ATCC 29544、ATCC

51329、ATCC29004，分離株10403.7和10403-14用於噬菌體的增值。

1．1．2 主要試劑和儀器：腦心浸液肉湯 (BHI)，difc公司；胰酪腖大豆腖瓊脂 (TSA)，營養瓊脂，北京路橋技術有限公司。M-13DNA純化試劑盒，美國promega公司產品，隨機引物，購自上betway必威西汉姆联亞生物技術有限公司。擴增設備為GeneAmp PCR 9700PCR(ABI),美國應用生物係統公司出品

     參照文獻 ［6］的方法，取北京朝陽市高碑店河水樣本，經脫脂棉過濾除去雜質，取100ml,加入1：100稀釋的阪崎腸杆菌普通營養肉湯24h培養物6ml，37℃培養3-4h後觀察噬菌斑。取雙層平板上單個噬菌斑（透明、寬直徑）的瓊脂塊加入5ml營養肉湯中，室溫放置1-2h後4℃過夜，次日取其0.1ml加入2ml肉湯培養基中，再加50μL相應宿主菌增菌液，混合後室溫放置15min,37℃培養過夜，培養液經無菌濾器（0.22μm微孔濾膜）過濾，將濾液分裝4℃保存。濾液適當稀釋後，重複以上步驟至少3次，即得到純化的噬菌體。

1.3   噬菌體滴度測定

     將噬菌體原種用液體培養基作10倍連續稀釋後，每稀釋度取10μL,加入到0.2ml宿主菌增菌液中，在雙層平板測定噬斑滴度，滴度（pfu/mL）=密度適當的平板上的噬斑數×稀釋倍數×100^［7］，通過觀察形成噬菌斑的情況確定工作滴度（Routine test dilution,RTD）.

1.4 特異性與裂解譜實驗

將27株阪崎腸杆菌分離株和其他7種來自ATCC的腸杆菌科細菌參考菌株和分離菌株的工作菌株經BHI增菌後，用無菌鑒沾取培養液塗布於營養瓊脂，將10μL滴度為10⁶-10⁹pfu/mL的噬菌體滴在阪崎腸杆菌塗布區域，37℃培養18-24h,通過觀察菌苔上是否形成噬菌斑的宿主範圍。

1.5  噬菌體的電子顯微鏡觀察

挑去3-4個噬菌斑轉到約400μL，SM的緩衝液（5.8g NaCl,2.0g MgSO₄·7H₂O,50mL的1mol/L Tris(pH=7.5),0.1g明膠，於1L去離子水中，100kPa滅菌15min）,樣品在室溫下放置1h,然後滴到碳質柵網上用乙酸雙氧軸進行負燃，使用philips/Tecnai12透射電鏡觀察和拍照。

1.6        噬菌體分子生物學特性

按照使用說明M-13DNA提取試劑盒提取噬菌體DNA。通過引物5^，-GAAACGGGTG-3^，對提取的噬菌體DNA進行隨機擴增多態性（Randomamplified polymorphic DNA,RAPD）實驗分析，比較擴增片段的大小，初步得到分離噬菌體的分子生物學特性^［8］.50μL反應液中含25μL 2xPCR混合液（Promega），0.5μmol(2μL)引物，1μL分離DNA作為模板。22μL蒸餾水，循環條件：94℃ 5min,94℃ 1min,37℃ 1min,72℃ 2min，40個循環；72℃ 10min.通過2％瓊脂糖凝膠電泳檢查擴增產物。首先檢查RAPD-PCR選擇的10個堿基長引物，在所有反應中設陰性對照，以確證擴增的可靠性。