細胞培養培養基

基礎培養基

 

絕大多數培養基是建立在平衡鹽溶液(BSS)基礎上，添加了氨基酸、維生素和其它與血清中濃度相似的營養物質。最廣泛應用的培養基是Eearle`s MEM 的混合物，其中含有13種必須氨基酸、8種維生素。而Ham`s F12 也包括非必須氨基酸，維生素的範圍亦很廣，另外常規含有無機鹽和代謝添加劑(例如核苷酸)。MEM/F12 這兩種培養基各取1/2，形成神經生物學最通用的培養基。Dulbecco`s改良培養基——DMEM，現應用於快速生長的細胞，同MEM含有相同的營養成分，但濃度高出2~4倍。選擇某種培養基，應仔細了解成分表，應知道大多數情形下培養基都有不足。例如，有些培養基在氨基酸中包括有穀氨酸，而這種培養基雖廣泛用於神經生物學領域，但它對某些對穀氨酸敏感的可能有細胞外毒性損傷的神經元而言，則並非最佳選擇，特別是如果神經元生長在缺乏膠質的環境中時。F12中含有硫酸亞鐵，據報道也有神經毒效應。

 

在所有這些培養基中，穀氨酸比其他氨基酸有更高的濃度，這是因為它具有不穩定性以及在許多細胞培養中它常用作碳源。對於神經元的培養常常在基礎培養基中增加葡萄糖的含量到0.6%或者加入丙酮酸(若培養基中這兩種物質缺乏時)。MEM與F12均要用5%的CO2來平衡，DMEM含更高濃度的NaCO3，要用10%的CO2來平衡，當然也可以在較低CO2濃度下使用。這些基礎培養基的組成成分是建立在對不同細胞係生長的研究之上的，但通常在原代培養中使用也能有比較令人滿意的結果。

 

原則上，HEPES作為緩衝劑可用來代替碳酸氫鹽，以解除需要高濃度CO2培養環境的限製。實際操作中並非如此簡單。顯然，溶解的CO2與碳酸氫鹽對良好的細胞生長是重要的。Leiboviz`s L15培養基可用來在大氣環境中令神經細胞生長，該培養基采用了與眾不同的BSS作基礎，它含有高濃度的氨基酸來提高緩衝能力，培養基中使用半乳糖作碳源，以阻止培養基中乳酸形成，少量溶解的CO2由丙酮酸代謝產生。這一培養基的優點是明顯的，特別是在保持較高CO2有困難時，例如在長時間的顯微操作及生理學研究中。L15培養基已用來成功的培養了外周神經元，但尚未在CNS神經元的發育研究中全麵檢測過。

 

血清

 

細胞在單純的基礎培養基中不能存活，在特殊類型的細胞培養中必須提供某些痕量營養物質及生長因子才能使細胞得以生長並維持生長狀態。基礎培養基常常要添加血清，血清終濃度多為5~20%。特殊用途的血清來源須用經驗確定，廣泛應用的血清種類有馬血清與胎牛血清。胎牛血清中富含有絲分裂因子，常選其作增殖細胞用的血清，也用於細胞係和原代培養。而馬血清常常用來作有絲分裂後的神經元培養。然而，很多人也將胎牛血清用於神經元培養，也有人用馬血清來培養膠質細胞。用大鼠進行神經元培養的某些研究者喜歡使用同型血清;人類的胎盤血清，亦曾用於神經組織的器官類型的培養，也用在一些特殊培養種類中。

 

血清的不同批號含有不同的成分，所以許多人發現，應該在使用前對血清進行測試。大多數試劑商提供樣品，所滿意的批號即可選用，這樣可以一次得到足夠一年用量的血清，血清在使用前通常在56℃加熱30分鍾，這一過程稱為滅活。

 

無血清培養基

 

1979年神經細胞培養出現了一個重要進展，用化學添加劑即可維持神經細胞存活與生長而不需要在培養基中添加血清。其工作基礎是用合適的激素、營養物和促貼壁的物質的組合置換培養基中的成分，最後找到了適合大多數細胞培養的試劑配方，該配方稱為N2，專門用於神經細胞培養，最早是用在B104大鼠神經母細胞瘤細胞係的培養。它的基礎培養基是1：1的DMEM與H12的混合液，添加了胰島素、轉鐵蛋白、黃體酮、腐胺和硒。胰島素和胰島素樣生長因子對於大多數類型細胞的存活和生長有重要作用，硒是穀胱甘肽產生的合作因子，可能有助於過氧化物和超氧化物的水解，有報道說還能防止細胞的光照損傷。隨後的其他配方如N1N3則含有較低濃度的轉鐵蛋白。

 

未料到的是上述配方構成的培養基可以支持神經母細胞瘤細胞係快速增殖，隨後又發展了能支持原代培養的各種神經元生長的培養基，這種培養基在許多實驗室裏已取代了有血清培養。在某些培養方案中，細胞直接進入無血清培養，這樣的培養基可以消除來自血清的不均一性。更為重要的是，它們可用來檢測生長因子以及其他促進神經元存活或生長的因子，或者用來檢測那些可保護神經元免遭環境毒物損傷的製劑。專用於神經元的培養基在某些培養環境中還可以減低非神經元細胞的增殖，故可使神經元純化。

 

血清中含有的組分，例如血清蛋白，可作為代謝毒物清除劑使用並能聚集於培養基中。當缺乏這些成分時，如神經元在無血清培養基中生長時，特別容易為過氧化物及自由基傷害，這已被許多研究者注意到了。過氧化物酶以及超氧化物歧化酶可阻止培養基中過氧化物和超氧化物的累積，有報道講可以促進低密度培養細胞的存活。有學者發現細胞存活可為氧分壓的下降而促進。因而，無血清培養基的配方常含有抗氧化劑的試劑。例如，維生素E和丙酮酸，可作為過氧化物清除劑使用。上述這些影響在高密度培養時變小，特別是神經元與膠質共培養時，它們可以吸收和代謝神經元毒性物質如穀氨酸。

 

應該注意，盡管無血清培養基是有化學限定性的，但在培養過程中它仍有變動，培養起始時可能有些物質缺乏，而後細胞的產物可能積累，從而使培養基的成分改變。這其實是有另一方麵的好處，即條件培養基(已培養過細胞的培養基)的形成，條件培養基常常用來增加神經元和膠質細胞的發育。

 

生長因子絕大多數哺乳類胚胎神經元有嚴格的營養要求，若不能提供適宜的生長因子或合適的因子組分，將會使絕大多數神經元在體外培養的數天中死亡。解決這一問題有兩條思路，一是讓培養細胞提供自己的營養因子，二是在培養基中加入純的生長因子。如果細胞混合物能在高密度時生長，所需的生長因子便會積累到可觀的數值，尤其當培養基很少變化時。若某種細胞混合物生長時有很少的營養需求，可保持培養基在一段時間裏不作任何變動，以使營養(生長)因子積累，而最後促使所需要的細胞類型能夠生長。但是，這種對營養(生長)因子自身倚賴性亦有弊端，因為通常在混合細胞群體中細胞很難有同比例增殖，某些細胞會因生長條件的貧乏而受限製。另外，這種方法隻能進行相當高密度的細胞培養。因為培養基的條件在細胞的較低密度時變的不夠有效。不過某些時候純化神經元群體的低密度培養可用條件培養基(經過了高密度培養)進行，或在膠質上生長的神經元所用過的培養基來支持。

 

滿足神經元營養需求的第二條途徑是向培養基中加入生長因子。通常用於組培的通用適宜因子是神經生長因子NGF。不過，隻有少數對這種蛋白質有反應的細胞類型的細胞才能生長。

 

許多PNS類型的神經元在離體狀態時表現出簡單的營養需求，隻需提供單一的營養因子就足以使其在低密度時增殖。例如，大鼠交感神經元僅需NGF即能存活，在其生存期間，這些神經元可在嚴格局限條件下生長好幾個月(即在無血清培養基中、或缺乏膠質細胞、或在化學限定基質上)。有證據表明NGF是活體中交感神經元存活的生理調節因子。然而，交感神經元也對來自膠質細胞的神經營養因子(GDNF)有反應，還有NT3、LIF與CNTF也對其有作用。在不產生GDNF或NT3的動物中，交感神經元會有損傷。在離體與活體營養需求之間的差別或許可以用在不同環境中NGF含量和分布的不同來解釋，培養中的NGF彌散在整個環境中，而在活體內，大部分區域的含量是有限的。因此，NGF的重要性在於其合適的濃度。盡管在大多數實驗中已經習慣了營養因子的最大效應使用量，其他營養因子的協同效應在亞優劑量下更容易觀察到。此外，高濃度的營養因子可使細胞更能抵抗毒劑以及其他壓力。相應的，低濃度的營養因子可能用來檢查表現型，例如對自由基或氨基酸的毒性刺激劑量的反應。有許多其他的PNS培養係統隻需單一營養因子就可使有實用價值的細胞保持在一定比例，廣為人知的有雛雞睫狀自主神經節神經元和大鼠背根神經節感覺神經元。不過，這些模型也有局限性。例如，培養中的睫狀神經節的神經元加入CNTF時，超過90%的神經元能存活一個很長時期，但並未有跡象表明它屬於內源的靶細胞來源的營養因子，而是有爭論的相關分子，GPA，扮演了這一角色。大鼠背根神經節含有好幾種細胞群體，其中小細胞群、包括nocioceptive cell，對NGF有反應，但其他神經元，例如大細胞群中的proprioception 卻對不同的神經營養因子有反應。因此，在大多條件下培養物的生長並不能忠實反映親代群體的所有特性，這一問題在CNS的細胞培養中特別突出，因為已有的經驗表明，沒有一種培養基能適合於所有類型及亞類的神經細胞的生長。

 

現有的證據已表明，CNS神經元的營養需求比PNS的更複雜。對脊髓運動神經元與視網膜節細胞神經元的研究表明，這些神經元與外周神經元相比能對更為廣泛的營養因子起反應。例如，至少發現了15種不同的分子可在離體條件下增加神經元的存活。而且，已觀察到運動神經元與視網膜對任何單獨的營養因子的存活反應，與PNS中所觀察到的典型反應相比，都要小得多。因此，大多數影響運動神經元及視網膜節細胞的營養因子僅僅隻能支持神經元的亞群，而神經元的最佳存活要求諸多因子的結合。在視網膜節細胞的培養中，因子的最佳組合(如BDNF、CNTF、IGF、bFGF)包括了來自不同生長因子家族的代表。這一結果的普遍性尚待進一步的證實，但敲除單一的營養因子基因之後，沒有表現出對CNS大多類群的神經元的存活產生太大影響，這一觀察與上述的事實是一致的。現已知少突膠質細胞的長期存活也需要眾多營養因子的相互作用。

 

抗生素

 

在細胞培養中最常用的抗生素是青黴素(常用濃度是25~100ui/ml)與鏈黴素(25~100μg/ml)。這兩種抗生素常混合使用。在一些實驗室裏，它們常規加入所有的培養基中。慶大黴素(10~100μg/ml)通常有廣譜抗菌效應，並具有溶液穩定性，故也被一些實驗室使用，特別是當有低水平的汙染存在時更是這樣。以上這些試劑對黴菌與酵母菌的汙染均無效。

 

盡管很多實驗室在細胞係的培養基中常規加入抗生素作繼代培養，但仍建議不要在原代培養中加入抗生素，其理由之一是獲得的細胞是無菌的，原代培養時的細菌汙染很少發生。其次，盡管認為抗生素對細胞代謝的影響可忽略，但最好避免使用它們，以免細胞生長環境的不穩定。最重要的是要意識到培養中主要汙染物的類型，它們通常暗示了問題的來源。

 

抗有絲分裂劑

 

某些DNA合成抑製劑對分裂細胞有毒，但對沒有DNA合成的細胞僅有輕微影響。由於神經元通常缺乏DNA合成能力，因此對抗有絲分裂劑沒有多大反應。這樣的試劑常常用於神經元的培養，以消除或減少非神經元群體。若要殺死所有的非神經元細胞，可以先加入血清或生長因子來保證有高比例的非神經元細胞進行DNA合成，此時再加入抗有絲分裂劑。但是，某些細胞在它的細胞周期的某些時相時對抗有絲分裂劑是不敏感的。不過，可以重複的將抗有絲分裂劑使用於增殖的細胞群體。在CNS神經元的培養中抗有絲分裂劑常常在星形細胞形成單層後加入，此時，星形細胞由於接觸抑製而終止了DNA的合成(即細胞停止增殖)，它們不會因抗有絲分裂劑的加入而死亡。原代培養中用這種方法阻止成纖維細胞的過度增殖是十分必要的。有兩種抗有絲分裂劑常用於神經元的培養：Fluorodexyuridine，是胸苷合成酶抑製劑，一般使用濃度為～10μM。尿苷(10μM)也常使用，可阻止不分裂細胞的RNA合成。另外，阿糖胞苷也常被使用，其使用濃度為5～50μM。使用任何一種抗有絲分裂劑，都必須考慮它的神經原毒性，應該確定最低效應的使用濃度。阿糖胞苷在很低的濃度下，也會對某些種類的神經元有毒性，可以造成特定神經原的死亡。其他的抗有絲分裂劑尚未表現出這種毒性。

 

培養的保持

 

培養物是應該保持在孵箱中的。孵箱可以自動將O2與CO2混合很快達到培養基的設計要求，空氣中的氧濃度比血液和腦脊液中要高得多。對於某些細胞的生長，包括神經原，應使氧含量處在一個較低的水平。可以用孵箱達到這個標準，但這樣的孵箱並未廣泛使用。

 

高濕度可避免培養皿中培養基的蒸發，保持孵箱中的濕度通常是在箱底部放上一大盆水，這水應該經常換，乘水容器應經常消毒以防黴菌生長。若孵箱曾被黴菌孢子嚴重汙染過，那麽要想完全去除汙染則會非常困難。當培養物必須要長期保持在孵箱中時，應采用較少培養基的瓶、皿，且將蓋子蓋緊以避免蒸發，或采用相應的按比例供空氣的孵箱。

 

溫度的精確調節應定期檢查，孵箱溫度常設置為37℃或較低溫度。細胞在低溫時可有較長時間的忍耐限度，但當溫度升至39℃時，幾小時內即死亡。

 

維持培養物的最佳方案常常改變。例如培養膠質細胞時，要經常換液以使其增殖達到最大。而在培養某些神經原時，則要求盡可能少的換液，神經原在兩次換液之間的條件下長的最好。大腦皮質的培養要求在不換液的情形下維持一個月以上。另一方麵，象海馬神經原那樣的細胞，倚賴於條件培養基，若換液太頻繁細胞就會衰退，此時，可采用1/3或1/2換液的方式。