實驗——微生物細胞大小的測定和顯微鏡直接計數

目的

1.1  學習接目測微計的校正方法， 了解血球計數板的構造和計數原理

1.2 學習使用顯微鏡測微尺測定微生物細胞大小，  掌握用血球計數板測定微生物細胞總數的方法。

2  原理

微生物細胞的大小是微生物分類鑒定的重要依據之一。微生物個體微小，必須借助於顯微鏡才能觀察，要測量微生物細胞大小，也必須借助於特殊的測微計在顯微鏡下進行測量。

顯微測微計由鏡台測微計和目鏡測微計兩部分組成。後者可直接用於測量細胞大小。它是一塊圓形玻片(圖7—1)，其中央有精確等分到度，測量時將其放在接目鏡中的隔板上。由於目鏡測微計所測量的是微生物細胞經過顯微鏡放大之後所成像的大小，刻度實際代表的長度隨使用的目鏡和物鏡放大倍數及鏡筒的長度而改變，所以，使用前須先用鏡台測微計進行標定，求出某一放大率下，目鏡測微計每一小格所代表的長度，然後用目鏡測微計直接測被測對象的大小。鏡台測微計是一塊中央有精確刻玻片(圖7—1)，刻度的總長為lmm，等分為100小格，每小格長10um，專用於對目鏡測微計進行標定的。

3  材料

3.1  器械

顯微鏡、目鏡測微尺、鏡台測微尺，載玻片、蓋玻片、血球計算板、擦鏡紙、吸水紙、玻片架、腎形盤、洗瓶、接種環、酒精燈、火柴、滴管。

3.2  菌種

培養48h的啤酒酵母斜麵菌體和菌懸液。

3.3  革蘭氏染液

4流程

4.1 置目測微計→置台測微計→標定目測微計→測菌體大小→記錄結果→用畢擦拭幹淨

4.2 檢查計數板→稀釋樣品→加樣→計數→計算→清洗

5  步驟

5.1  微生物菌體大小的測定

5.1.1  目鏡測微尺的校正

5.1.1.1  更換目鏡鏡頭 

更換目鏡測微尺鏡頭（標記為PF）；或者取下目鏡上部或下部的透鏡，在光圈的位置上安上目鏡測微尺，刻度朝下，再裝上透鏡，製成一個目鏡測微尺的鏡頭。

5.1.1.2  某一倍率下標定目鏡刻度

將鏡台測微尺置於載物台上，使刻度麵朝上，先用低倍鏡對準焦距、看清鏡台測微尺的刻度後，轉動目鏡，使目鏡測微尺與鏡台測微尺的刻度平行，移動推動器使兩尺重疊，並使二尺的左邊的某一刻度相重合，向右尋找另外二尺相重合的刻度。記錄兩重疊刻度間的目鏡測微尺的格數和鏡台測微尺的格數(圖7-1C)。

5.1.1.3  計算該倍率下目鏡刻度 

目鏡測微尺每格長度=鏡台測微尺格數/目鏡測微尺格數xl0um

5.1.1.4  標定並計算其他放大倍率下的目鏡刻度

以同樣方法分別在不同倍率的物鏡下測定目鏡測微尺每格代表的實際長度。如此測定後的測微尺的長度，僅適用於測定時使用的顯微鏡以及該目鏡與物鏡的放大倍率。

5.1.2  菌體大小的測定

5.1.2.1  將啤酒酵母製成水浸片。

5.1.2.2  大小換算

將標本先在低倍鏡下找到目的物，然後在高倍鏡下用目鏡測微尺測定每個菌體長度和寬度所占的刻度，即可換算成菌體的長和寬。

5.1.2.3  求平均值

一般測量微生物細胞的大小，用同一放大倍數在同一標本上任意測定l0一20個菌體後，求出其平均值即可代表該菌的大小。

5.2  用血球計數板測定微生物細胞的數量

5.2.1  檢查血球計數板 

取血球計數板一塊，先用顯微鏡檢查計數板的計數室，看其是否沾有雜質或幹涸著的菌體，若有汙物則通過擦洗、衝洗，使其清潔。鏡檢清洗後的計數板，直至計數室無汙物時才可使用。

5.2.2  稀釋樣品

將培養後的酵母培養液振蕩振搖混勻，然後作一定倍數的稀釋。稀釋度選擇以小方格中的分布的菌體清晰可數為宜。一般以每小格內含4～5個菌體的稀釋度為宜。

5.2.3  加樣

取出一塊幹淨蓋玻片蓋在計數板中央。用滴管取1滴菌稀釋懸液注入蓋玻片邊緣，讓菌液自行滲入，若菌液太多可用吸水紙吸去。靜置5—10分鍾。

5.2.4  鏡檢

待細胞不動後進行鏡檢計數。先用低倍鏡找到計數室方格後，再用高倍鏡測數。一般應取上下及中央五個中格的總菌數。計數時若遇到位於線上的菌體，一般隻計數格上方（下方）及右方（左方）線上的菌體。每個樣品重複3次。

5.2.5  計算 

取以上計數的平均值，按下列公式計算出每毫升菌液中的含菌量。

菌體細胞數（cfu/mL）＝小格內平均菌體細胞數×400×104×稀釋倍數

5.2.6  清洗 

計數板用畢後先用95%的形酒精輕輕擦洗，再用蒸餾水淋洗，然後吸幹，最後用擦鏡紙揩幹淨。若計數的樣品是病原微生物，則須先浸泡在5%石炭酸溶被中進行消毒，然後再行清洗。清洗後放回原位，切勿用硬物洗刷。

圖7-2 血細胞計數板

6  結果

6.1計算出目鏡測微尺在低、高倍鏡下的刻度值。

6.2 記錄菌體大小的測定結果。

6.3 計算樣品中酵母菌濃度。

7  思考

7.1  為什麽隨著顯微鏡放大倍數的改變，目鏡測微計每格相對的長度也會改變？能找出這種變化的規律嗎？

7.2  根據測量結果，為什麽同種酵母菌的菌體大小不完全相同？

7.3  能否用血球計數板在油鏡下進行計數？為什麽？

7.4 根據自己體會，說明血球計數板計數的誤差主要來自那些方麵？如何減少誤差？ 

8 附錄

目鏡測數尺有兩種：一是特製的目鏡鏡頭，鏡片上刻有50等分或100等分的刻度，使用時直接安裝在顯微鏡上，取代沒有刻度的目鏡鏡頭；另一種是一塊直徑大約17.5 mm的圓玻璃片，其中央刻有50等分或100等分的刻度(圖7-1A)，使用時將該玻璃片安裝在原來的目鏡鏡頭上即可。由於不同的顯微鏡放大倍數不同，既使同一顯微鏡在不同的目鏡、物鏡組合下其放大倍數也不同，故目鏡測微尺每格實際表示的長度隨顯微鏡放大倍數不同而異。也就是說，目鏡測微尺上的刻度隻代表相對的長度。因此在使用前須用鏡台測微尺校正，以確定在一定放大倍數下目鏡測微尺的每格長度。

血球計數板是一塊特別的厚玻片，玻片中央分剖成兩個平麵，上麵各刻有9區，中央一區為計數室，供計數用(圖7-2A)，此區的長和寬各為1mm。中央平麵兩側有小溝，小溝外有兩條突起的平台，平台比中央平麵高0.1mm，因此計數室體積為0.1mm³，容積為10^-4ml。通常計數室分為25個大格，每大格又分為16個小格，每小格容積為4×10^-6ml，即lml菌液容積相當於400萬個小格體積。因此隻要將細胞懸液注人計算室，計算出一定數量小格的平均菌數即可算出每毫升的細胞數。