實驗——微生物菌種常規保藏方法

菌種是一種重要的生物資源，菌種保藏是重要的微生物基礎工作。菌種保藏就是利用一切條件使菌種不死、不衰、不變，以便於研究與應用。

1 目的

1.1 了解菌種保藏的基本原理

1.2 掌握幾種常用的菌種保藏方法。

2 原理

菌種保藏的方法很多。其原理卻大同小異，不外乎為優良菌株創造一個適合長期休眠的環境,即幹燥、低溫、缺乏氧氣和養料等。使微生物的代謝活動處於最低的狀態，但又不至於死亡，從而達到保藏的目的。依據不同的菌種或不同的需求，應該選用不同的保藏方法。一般情況下，斜麵保藏、半固體穿刺,石蠟油封存和砂土管保藏法較為常用，也比較容易製作。

3 材料

3.1菌株 

待保藏的適齡菌株斜麵

3.2培養基  

肉湯蛋白腖斜麵，半固體及液體培養基。

3.3 試劑

10%HCl無水氯化鈣、石蠟油、五氧化二磷。

3.4 器具

用於菌種保藏的小試管(10*100毫米)數支、5毫升無菌吸管、l毫升無菌吸管等、滅菌鍋、真空泵、幹燥器、冰箱無菌水、篩子(40目、120目)、標簽、接種針、接種環、棉花、牛角匙等等。

4 流程

斜麵保藏→半固體穿刺保藏→石蠟油封存→砂土管保藏 

5 步驟

5.1斜麵保藏

5.1.1流程

標記試管→接種→培養→保藏

5.1.2步驟

5.1.2.1貼標簽

取無菌的肉湯蛋白腖斜麵數支。在斜麵的正上方距離試管口2-3厘米處貼上標簽。在標簽紙上寫明接種的細菌菌名、培養基名稱和接種日期。

5.1.2.2斜麵接種

將待保藏的細菌用接種環以無菌操作在斜麵上作劃線接種。

5.1.2.3培養

置37恒溫箱中培養48小時。

5.1.2.4保藏

斜麵長好後，直接放入4℃的冰箱中保藏。這種方法一船可保藏三個月至半年。

5.2半固體穿刺保藏

5.2.1流程

標記試管→穿刺接種→培養→保藏

5.2.2 步驟  

5.2.2.1貼標簽

取無菌的半固體肉湯蛋白等直立柱數支，貼上標簽，注明細菌菌名、培養基名稱和接種日期。

5.2.2.2穿刺接種

用接種針以無菌方式從待保藏的細菌斜麵上挑取菌種，朝直立柱中央直刺至試管底部，然後又沿原線拉出。 

5.2.2.3培養

置37恒溫箱中培養48小時。

5.2.4保藏

半固體直立柱長好以後，放入4℃的冰箱中保藏。這種方法一般可保藏半年至一年。

5.3石蠟油封存

5.3.1流程

標記試管→接種→培養→加石蠟油→保藏

5.3.2 步驟

5.3.1標記

同5.1.2.1

5.3.2接種

同5.1.2.2

5.3.3培養

同5.1.2.3

5.3.4加石蠟油

無菌操作下將5毫升石蠟油到培養好的菌種上麵，加入的量以超過斜麵或直立柱1厘米高為宜。

5.3.5保藏：石蠟油封存以後，同樣放入4℃冰箱中保存。也可直接放在低溫幹燥處保藏。這種方法保藏期一般為一至二年。

5.4砂土管保藏

5.4.1 流程

製沙土管→滅菌→製菌液→加樣→幹燥→保藏

5.4.2 步驟

5.4.2.1製作沙土管

選取過40目篩的黃砂，酸洗，再水洗至中性，烘幹備用；過120目篩子的黃土備用；按1份土加4份砂的比例均勻混合後，裝入小試管，裝量1厘米左右。

5.4.2.2滅菌

加壓蒸汽滅菌，直至檢測無菌為止。

5.4.2.3製備菌液

取3毫升無菌水至待保藏的菌種斜麵中，用接種環輕輕刮下菌苔。震蕩製成菌懸液。

5.4.2.4加樣

用1毫升吸管吸取上述懸液0.1毫升至砂土管，再用接種環拌勻。

5.4.2.5幹燥

把裝好菌液的砂土管放入幹燥器或同時用真空泵連續抽氣，使之幹燥。

5.4.2.6保藏

幹燥後的砂土管可直接放入冰箱中保藏；也可以用石蠟封住棉花塞後放冰箱中保藏。