實驗——沙門氏菌屬（Salmonella）的檢驗

1 目的

1.1 理解沙門氏菌屬生化反應及其原理

1.2 掌握沙門氏菌屬血清因子使用方法

1.3 掌握沙門氏菌屬的係統檢驗方法

2 原理

沙門菌屬是一大群寄生於人類和動物腸道，其生化反應和抗原構造相似的革蘭氏陰性杆菌。種類繁多，少數隻對人致病。其他對動物致病，偶爾可傳染給人。主要引起人類傷寒，副傷寒以及食物中毒或敗血症。在世界各地的食物中毒中，沙門氏菌食物中毒常占首位或第二位。

食品中沙門氏菌的檢驗方法有五個基本步驟：1 前增菌；2 選擇性增菌；3 選擇性平板分離沙門氏菌；4 生化試驗，鑒定到屬；5 血清學分型鑒定。目前檢驗食品中的沙門氏菌是按統計學取樣方案為基礎，25g食品為標準分析單位。本實驗以蛋品為檢測樣品，以已知的沙門氏菌和大腸埃希氏菌為對照。

3 材料

3.1 菌種

沙門氏菌（Salmonella sp.）

大腸埃希氏菌（E.col.）

3.2 檢樣

凍肉、蛋品、乳品等。

3.3 培養基

緩衝蛋白腖水（BP）、氯化鎂孔雀綠（MM）增菌液、四硫酸鈉煌綠（TTB）增菌液、亞硒酸鹽胱氨酸（SC）增菌液、SS瓊脂、EMB瓊脂、亞硫酸鉍瓊脂（BS）、三糖鐵瓊脂（TSI）、蛋白腖水、尿素培養基、賴氨酸脫羧酶試驗培養基、鳥氨酸脫羧酶試驗培養基、丙二酸鈉培養基、氰化鉀（KCN）培養基、ONPG培養基、緩衝葡萄糖蛋白腖水、DHL瓊脂、HE瓊脂。

3.4 試劑

吲哚試劑、V-P試劑、甲基紅試劑、氧化酶試劑，沙門菌A—F多價診斷血清，革蘭氏染色液等。

3.5 器具

天平（稱取檢樣用）、均質器或乳缽、顯微鏡、廣口瓶、三角燒瓶、吸管、平皿、金屬匙或玻璃棒、接種棒、試管架。

4 流程

 

5 步驟

5.1 前增菌和增菌 

沙門氏菌在食品加工過程中，常常受到損傷而處於瀕死狀態，因此經過加工的食品檢驗沙門氏菌時應進行前增菌，即用不加任何抑菌劑的培養基緩衝蛋白腖水（BP），進行增菌，使瀕死狀態的沙門氏菌恢複活力。一般增菌時間為4h，增菌時間不宜過長，由於BP培養基中沒有抑菌劑，時間太長了，雜菌也會相應增多。幹蛋品特殊，蛋品中的主要病原菌為沙門氏菌，其在加工過程中受到的損傷又較嚴重，因此應適當延長前增菌時間，一般為18～24h。

無菌操作稱凍蛋取25g樣品，加入盛有225mL滅菌緩衝蛋白腖水的500mL廣口瓶內（瓶內預放玻璃珠若幹粒），塞緊瓶口，充分搖勻。在36±1℃培養4h（幹蛋品需培養13～24h），移10ml氯化鎂孔雀綠增菌液或四硫酸鈉煌綠增菌液，在42℃培養18～24h。同時另取10ml，加入100ml亞硒酸鹽胱氨酸（SC）增菌液內，在36±1℃培養18～24h。

鮮肉、鮮蛋、鮮乳或其他未經加工的食品不必經過前增菌。各取25g（25ml）加入滅菌生理鹽水25mL，按前法做成檢樣勻液，取半量，接種於100mLMM（或TTB）增菌液內，於42 oC培養24h；另半量接種於100mLSC增菌液內，於36±1 oC培養18～24h。

5.2 分離

取增菌液和混合液各1環，分別劃線接種於一個BS平板和一個DHL瓊脂平板（或HE瓊脂平板、WS或SS瓊脂平板）。於36±1 oC培養18～24h（DHL、HE、WS、SS）或40～48h（BS），觀察各個平板上生長的菌落。先觀察混合菌種平板，再檢查樣品平板上有無可疑菌落，挑取菌種平板和樣品平板上的可疑菌落進行革蘭氏染色與鏡檢。

5.3 三糖鐵高層瓊脂初步鑒別

將上述革蘭氏陰性杆菌的可疑菌落，挑取數個接種一支三糖鐵高層瓊脂斜麵，於36±1 oC培養18～24h，並根據表4-1初步判斷是否可疑沙門氏菌。

5.4 生化試驗

在接種三糖鐵瓊脂的同時，接種蛋白腖水（供做靛基質試驗）、尿素瓊脂（pH7.2）、氰化鉀（KCN）培養基和賴氨酸脫羧酶試驗培養基及對照培養基各1管，於36±1 oC培養18～24h，必要時可延長至48h，按表4-2判定結果。按反應序號分類，沙門氏菌屬的結果應屬於A1、A2和B1，其它5種反應結果均可以排除。

表4－2  腸杆菌科各屬生化反應初步鑒別表

5.4.1 反應序號A1 

典型反應判定為沙門氏菌屬。如尿素、KCN和賴氨酸3項中有1項異常，按表4-3可判定為沙門氏菌。如有2項異常，則按A3判定為弗勞地氏檸檬酸杆菌。

表4－3  沙門氏菌屬生化鑒別表

5.4.2 反應序號A2     

可先作血清學鑒定，如A～F多價O血清不凝聚時，補做甘露醇和山梨醇試驗，按表4-4判定結果。

表4-4

5.4.3 反應序號B1 

三糖高層斜麵產酸的菌株可予以排除，不產酸的應該先作血清學鑒定。如A～F多價O血清不凝聚時，補做鳥氨酸、ONPG，水楊苷、棉子糖和半動力試驗。按表4-5 判斷結果。必要時按表4-6進行沙門氏菌生化群的鑒別

表4－5  沙門氏菌屬各生化群的鑒別

表4－6  沙門氏菌屬各生化群的鑒別

5.5 血清學分型鑒定

5.5.1  抗原的準備

一般采用1.5%瓊脂斜麵培養物作為玻片凝集試驗用的抗原。O血清不凝集時，將菌株接種在瓊脂量較高的（如 2.5%～3%）培養基上檢查，O抗原在幹燥環境中發育較好；如果是由於Vi抗原的存在而阻止了O凝集反應時，可挑取菌苔於1mL生理鹽水中做成濃菌液，於酒精燈火焰上煮沸後再檢查。H抗原發育不良時，將菌株接種在0.7%～0.8%半固體瓊脂平板的中央，待菌落蔓延生長時，在其邊緣部分取菌檢查；或將菌株通過裝有0.3～0.4%半固體瓊脂的小玻管1～2次，自遠端取菌培養後再檢查。

5.5.2  O抗原的鑒定

用A～F多價O血清做玻片凝集試驗，同時用生理鹽水做對照。在生理鹽水中自凝者為粗糙形菌株，不能分型。

被A～F多價O血清凝集者，一次用O4、O3.10、O7、O8、O9、O2和O11因子血清做凝集試驗。根據試驗結果，判定O群。被O3.10血清凝集的菌株，再用O10、O15、O34、O19單因子血清做凝集試驗，判定E1、E2、E3、E4各亞群，每一個O抗原成分的最後確定均應根據O單因子血清的檢查結果，沒有O單因子血清的要用兩個O複合因子血清進行核對。

不被A～F多價O血清凝集者，先用57種或163種沙門氏菌因子血清中的9種多價O血清檢查，如有其中一種血清凝集，則用這種血清所包括的O群血清逐一檢查，以確定O群。每種多價O血清所包括的O因子如下：

O多價1  A，B，C，D，E，F群（並包括6，14群）

O多價2  13，16，17，18，21群

O多價3  28，30，35，38，39群

O多價4  40，41，42，43群

O多價5  44，45，47，48群

O多價6  50，51，52，53群

O多價7  55，56，57，58群

O多價8  59，60，61，62群

O多價9  63，65，66，67群

5.5.3  H抗原的鑒定

屬於A～F各O群的常見菌型，依次用表7所述H因子血清檢查第1相和第2相的H抗原。

表4-7   A～F群常見菌型H抗原表

不常見的菌型，先用163種沙門氏菌因子血清中的8種多價H血清檢查，如有其中一種或兩種血清凝集，則再用這一種或兩種血清所包括的各種H因子血清逐一檢查，以確定第1相和第2相的H抗原。8種多價H血清所包括的H因子如下：

H多價1  a，b，c，d，i

H多價2  eh，enx，enz15，fg，gms，gpu，gq，mt，gz51

H多價3  k，r，y，z，z10，lv，lw，lz13，lz28，lz40

H多價4  1，2；1，5；1，6；1，7；z6

H多價5  z4z23，z4z24，z4z32，z29，z35，z36，z38

H多價6  z39，z41，z42，z44

H多價7  z52，z53，z54，z55

H多價8  z56，z57，z60，z61，z62

每一個H抗原成分的最後確定均應根據H單因子血清的檢查結果，沒有H單因子血清的要用兩個H複合因子血清進行核對。

檢出第1相H抗原而未檢出第2相H抗原的或檢出第2相H抗原而未檢出第1相H抗原的，可在瓊脂斜麵上移種1～2代後再檢查。如仍隻檢出一個相的H抗原，要用位相變異的方法檢查其另一個相。單相菌不必作位相變異檢查。

5.5.4  Vi抗原的鑒定

用Vi因子血清檢查。已知具有Vi抗原的菌型有：傷寒沙門氏菌，丙型副傷寒沙門氏菌，都柏林傷寒沙門氏菌。

6 結果

綜合以上生化試驗和血清學分型鑒定的結果，按照表或有關沙門氏菌屬抗原表判定菌型，並報告結果。

7 思考題

7.1 如何提高沙門氏菌得檢出率？

7.2 沙門氏在三糖鐵培養基上的反應結果如何？為什麽？

7.3 沙門氏菌檢驗有哪五個基本步驟？

7.4 食品中能否允許有個別沙門氏菌存在？為什麽？