實驗——食品中病原性大腸埃希氏菌的檢驗

1 目的

1.1 了解病原性大腸艾希氏菌的種類於非病原性大腸艾希氏菌的區別。

1.2 掌握病原性大腸艾希氏菌檢驗的原理和方法。

2 原理

正常情況下，大腸艾希氏菌不致病，而且還能合成維生素B和K，生產大腸菌素，對

機體有利。但當機體抵抗力下降或大腸艾希氏菌侵入腸外組織或器官時，可作為條件性致病菌而引起腸道外感染。有些血清型可引起腸道感染，已知的引起致病性大腸艾希氏菌有四類，即產腸毒素大腸艾希氏菌、出血性大腸艾希氏菌、腸道侵襲性大腸艾希氏菌和腸道致病性大腸艾希氏菌，後者主要引起新生兒的腹瀉。帶菌的牛和豬是傳播本菌引起食物中毒的重要原因，人的帶菌亦可汙染食品，引起中毒。

3 材料

3.1 菌種和食品檢樣

產不耐熱腸毒素（LT）和產耐熱腸毒素（ST）大腸艾希氏菌標準菌株、食品檢樣。

3.2 試劑和培養基 

多粘菌素B紙片；0.1％硫椰汞溶液；2％伊文思藍溶液；革蘭氏染色液。

乳糖膽鹽發酵管；營養肉湯；腸道茵增菌肉湯；麥康凱瓊脂；伊紅美藍瓊脂(EMB)；三糖鐵瓊脂(TSI)；克氏雙糖鐵瓊脂(KI)；糖發形管(乳糖、鼠李糖、木糖和甘露醇)；賴氨酸脫羧酶試驗培養基；尿素瓊脂(pH7．2)；氰化鉀培養基；蛋白陳水、靛基質試劑；半固體瓊脂；Honda氏產毒肉湯；E1ek氏培養基；氧化酶試劑。 

3.3 動物和血清

小白鼠：1日齡一4日齡；致病性大腸艾希氏茵診斷血清；侵襲性大腸艾希氏菌診斷血清；產腸毒素大腸艾希氏菌診斷血清；出血性大腸艾希氏茵診斷血清；產腸毒素大腸艾希氏茵LT和ST酶標診斷試劑盒；抗LT抗毒素。

3.3 設備與材料  

天平；均質器或乳缽；溫箱(36土1)℃、42℃；水浴：顯微鏡；離心機；酶標儀；細菌濃度比濁管；滅菌廣口瓶；滅菌三角燒瓶；滅菌平皿；滅菌試管；滅菌吸管；橡膠乳頭；載玻片；酒精燈；滅茵金屬匙或玻璃棒；接種棒、鎳鉻絲；)接種棒、鎳鉻絲；試管架、試管簍；冰箱；注射器；滅菌的刀子、剪子、鑷子；硝酸纖維素濾膜。

4 流程

 

5 操作方法

5.1 增菌

樣品采集後應盡快檢驗。以無菌操作稱取檢樣25g，加在225mL營養肉湯中，以均質器打碎1min或用乳缽加滅菌砂磨碎。取出適量，接種乳糖膽鹽培養基，以測定大腸菌群MPN，其餘的移入500mL廣口瓶內，於36土1℃培養6h。挑取1環，接種於1管30mL腸道菌增菌肉場內，於42℃培養18h。

5.2 分離

將乳糖發酵陽性的乳糖膽鹽發酵管和增菌液分別劃線接種麥康凱或伊紅美藍瓊脂乎板；汙染嚴重的檢樣，可將檢樣勻液直接劃線接種麥康凱或伊紅美藍乎板，於36土1℃培養18h一24h，觀察菌落。不但要注意乳糖發酵的菌落，同時也要注意乳糖不發酵和遲緩發酵的菌落。

5.3 生化試驗

5.3.1 自鑒別平板上直接挑取數個菌落分別接種三糖鐵(TSl)或克氏雙糖鐵瓊脂(KI)。同時將這些培養物分別接種蛋白腖水、半固體、pH7．2尿素、瓊脂、KCN肉湯和賴氨酸脫羧酶試驗培養基。以上培養物均在36℃培養過夜。

5.3.2 TSI斜麵產酸或不產酸，底層產酸，H2S陰性，KCN陰性和尿素陰性的培養物為大腸艾希氏茵。TSI底層不產酸，或H2S、KCN、尿素有任一項為陽性的培養物，均非大腸艾希氏菌。必要時做氧化酶試驗或革蘭氏染色鏡檢。

5.4 血清學試驗  

5.4.1 假定試驗

挑取經生化試驗證實為大腸艾希氏菌的瓊脂培養物，用致病性大腸艾希氏菌、侵襲性大腸艾希氏苗、產腸毒素大腸艾希氏茵多價O血清和出血性大腸艾希氏苗O157，血清做玻片凝集試驗。當與某一種多價O血清凝集時，再與該多價血清所包含的單價O血清做試驗。致病性大腸艾希氏茵所包括的O抗原群見表9—1。如與某一個單價O血清呈現強凝集反應，即為假定試驗陽性。

5.4.2 證實實驗

製備O抗原懸液，稀釋至與MacFarland 3號比濁管相當的濃度。原效價為1:160—1:320的O血清，用0.％鹽水稀釋至1:40。稀釋血清與抗原懸液在10mm×75mm試管內等量混合，做試管凝集試驗。混勻後放於50℃水浴箱內，經16h後觀察結果。如出現凝集，可證實為該O抗原。

5.5 腸毒素試驗

5.5.1 酶聯免疫吸附試驗檢測LT和ST

5.5.1.1 產毒培養 

將試驗菌株和陽性及陰性對照菌株分別接種於0.6mLCAYE培養基內，37℃振蕩培養過夜。加入20000IU／ml的多粘菌素B0.05mL，於37℃培養1h，4000r／min離心15min，分離上清液，加入0.1％硫柳汞0.05ml，於4℃保存待用。

5.5.1.2  LT檢測方法(雙抗體夾心法)

包被：先在產腸毒素大腸艾希氏茵CT和ST酶標診斷試劑盒中取出包被用LT抗體管，加入包被液0.5ml，混勻後全部吸出於3.6ml包被液中混勻，以每孔100μl量加入到40孔聚苯乙烯硬反應板中，第一孔留空作對照，於4℃冰箱濕盒中過夜。

洗板：將板中溶液甩去，用洗滌液I洗3次，甩盡液體，翻轉反應板，在吸水紙上拍打，去盡孔中殘留液體。

封閉：每孔加100μL封閉液，於37℃水浴中lh。

洗板：用洗滌液II洗3次，操作同上。

加樣本：每孔分別加多種試驗菌株產毒培養液100μl，37℃水浴中lh。

洗板：用洗滌液II洗3次，操作同上。

加酶標抗體：先在酶標LT抗體管中加0.5ml稀釋液，混勻後全部吸出於3.6ml稀釋液中混勻，每孔加100μl，37℃水浴中1h。

洗板：用洗滌液II洗3次，操作同上。

酶底物反應：每孔(包括第一孔)各加基質液100μl，室溫下避光作用5min~10min，加入終液50μl。

結果判定：以酶標儀在波長492nm下測定吸光度0D值，待測標本OD值大於陰性對照3倍以上為陽性，目測顏色為桶黃色或明顯高於陰性對照為陽性。

5.5.1.3  ST檢測方法(抗原競爭法)   

包被：先在包被用ST抗原管中加0.5ml包被液，混勻後全部吸出於1. 6ml包被液中混勻，以每孔50μl加入於40孔聚苯乙烯軟反應板中。加液後輕輕敲板，使液體布滿孔底。第一孔留空作對照，置4℃冰箱濕盒中過夜。

洗板：用洗滌液I洗3次，操作同上。

封閉：每孔加100μl封閉液，37℃水浴比。

洗板：用洗滌液II洗3次，操作同上。

加樣本及ST單克隆抗體：每孔分別加各試驗菌株產毒培養液50μl、稀釋的ST單克隆抗體50μl (先在ST單克隆抗體管中加0.5mL稀釋液，混勻後全部吸出於1.6ml稀釋液中，混合)，37℃水浴1h。

洗板：用洗滌液II洗3次，操作同上。    •

加酶標記兔抗鼠1g複合物：先在酶標記免抗鼠1g複合物管中加0.5mL稀釋液，混勻後全部吸出於3.6mL稀釋液中混勻，每孔加100μl，37℃水浴1h。

洗板：用洗滌液II洗3次，操作同上。

酶底板反應：每孔(包括第一孔)各加基質液100μl，室溫下避光5min~10min，再加入終止液50μl。

結果判定：以酶標儀在波長492nm下測定吸光度OD值：

 

 

   目測無色或明顯淡於陰性對照為陽性。

5.5.2 雙向瓊脂擴散試驗檢測LT

將被檢菌株按五點環形接種於E1ek氏培養基上。以同樣操作，共做兩份，於36℃培養48h。在每株菌苔上放多粘菌素B紙片，於36℃經5h～6h，使腸毒素滲入瓊脂中，在距五點環形菌苔各5mm處的中央，挖一個直徑4mm的圓孔，並用一滴瓊脂墊底。在平板的中央孔內滴加LT抗毒素30μl，用已知產LT和不產毒菌作對照，經15h～20h觀察結果。在菌斑和抗毒素孔之間出現白色沉澱帶者為陽性，無沉澱帶者為陰性。

5.5.3 乳鼠灌胃試驗檢測ST

將被檢菌株接種於Honda氏產毒肉湯內，於36℃培養24h，以3000r／min離心30min，取上清液經薄膜濾器過濾，加熱60℃30min，每mL濾液內加入2％伊文思藍溶液0.02mL。將此濾液用塑料小管注入1日齡一4日齡的乳鼠胃內0.1mL，同時接種3隻～4隻，禁食3h～4h後用三氯甲烷麻醉，取出全部腸管，稱量腸管(包括積液)重量及剩餘體重。腸管重量與剩餘體重之比大於0.09為陽性，0.07—0.09為可疑。

6 結果 

6.1 通過實驗，有否檢出致病性大腸艾希氏菌？

6.2 綜合以上生化試驗、血清學試驗、腸毒素試驗作出報告

7 思考題

1 致病性大腸艾希氏菌有哪幾種?主要引起哪幾種症狀的疾病?

2 怎樣預防致病性大腸艾希氏菌引起的食物中毒?

3 致病性大腸艾希氏菌的檢驗程序。